一作寄语
李志清 讲师
海军军医大学基础医学院免疫学教研室
单细胞测序技术从诞生至今，仅仅短短几年的时间，便取得了飞速的发展以及瞩目的成果， 帮助科研人员在单细胞亚群的层面更加准确的研究细胞的特性和功能。我所在的课题组长期从事免疫细胞的起源分化发育，特殊疾病模型中免疫细胞的特性和功能等。单细胞测序技术确实让我们能够将无法在流式上分开的亚群准确的鉴定出来，让我们看到细胞的异质性，并准确的分析细胞亚群的变化和相关功能的改变。
最初选择BD Rhapsody™单细胞测序平台，是因为我们要分析的细胞数量很少，需要多个样品混在一起，才能达到一个样品的细胞数量。由于BD Rhapsody™单细胞测序平台的灵活性比较高，可以通过样品标签实现混样，通过AbSeq实现对膜表面蛋白进行同时分析。所以我们开始尝试利用碧迪医疗单细胞平台进行实验。在最初的实验阶段，得到了实验技术人员的帮助，在数据的分析阶段，无论是SeqGeq软件还是R语言分析都得到了生信团队的大力支持。从最初的TTA，WTA, AbSeq到后来的联合TCR测序，我们一直在碧迪医疗单细胞技术团队的协作下，不断进步。感谢碧迪医疗单细胞团队这些年对我们的帮助！
研究背景
接种新冠疫苗者在感染后呈现无症状到中度症状，降低了COVID-19的严重程度，然而Omicron能中和因疫苗接种或曾感染引起的抗体，从而逃逸机体识别。在接种疫苗或曾感染的个体中，免疫细胞被重新印记，T细胞对Omicron刺突蛋白的反应已被证明降低了50%以上，因此，适应性免疫不足以解释疾病严重程度的降低，适应性免疫之外的免疫机制可能在抗Omicron感染中发挥有效作用。
此前Omicron感染的免疫印记尚不清楚，2022年11月16日，海军军医大学、南开大学、北京协和医学院和广州实验室等多个单位在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38）上联合发表了题为《Innate immune imprints in SARS-CoV-2 Omicron variant infection convalescents》的文章，通过BD Rhapsody单细胞多组学技术刻画了人类Omicron感染的先天免疫景观，发现了新的中性粒细胞亚群，阐明了疾病严重程度降低的机制。
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实验方法
样本设置：
单细胞多组学技术分析：
• TTA SCRNA-seq和AbSeq：来自23名Omicron BA.1轻、中度康复者和6名健康志愿者的PBMC样本。
• WTA SCRNA-seg：来自18名康复者和6名健康志愿者的PBMC样本。
细胞因子和趋化因子测定：来自143名Omicron BA.1康复者、48名健康志愿者的血浆。
单细胞多组学技术应用：
靶向转录组，BD Rhapsody™ immune response panel ，货号633750
抗体panel IDP试剂盒，BD Rhapsody™ human immune discovery panel，货号625970
全转录组，BD Rhapsody™ WTA Amplification kit，货号633801
人混样标签试剂盒，BD Rhapsody Human single cell multiplexing kit，货号633781
生信分析平台版本，BD Rhapsody Analysis Pipeline v1.10.1
主要结论
1、Omicron恢复期血浆细胞因子和趋化因子表达谱
为了评价Omicron BA .1感染患者恢复期的免疫特性，作者先测定了恢复期和健康人的血浆中27种细胞因子和趋化因子的表达水平。发现恢复期存在一定程度的先天免疫激活，有17种在恢复期血浆中高于对照组 (图1b)，轻度恢复期IL-1β显著富集，中度恢复期IFN-γ诱导蛋白CXCL10显著丰富(图1c)。
2、Omicron患者恢复期外周血免疫细胞图谱
为了更好地描述感染恢复期样本的免疫特性，作者用BD Rhapsody单细胞系统对新鲜PBMC进行了TTA和AbSeq测序，获得413,299个优质单细胞，通过AbSeq（图S3）和mRNA共同注释出CD4+ T、CD8+ T、NK、单核、γδ T和低密度中性粒(LDNs) 5大类细胞，细分为34个细胞亚群（图2a），呈现先天免疫和适应性免疫的非凡异质图景。同时鉴定了前面提到的在恢复期中增加的细胞因子和趋化因子的主要细胞来源（图S4b）。
3、感染和疾病程度对恢复期先天免疫细胞组成及免疫应答的影响
作者接下来分析了感染和疾病程度对细胞群组成的影响，发现恢复期仍保持一定程度的免疫应答状态，相对于健康供体，恢复期VNN2hi单核、HLA-DMAhi单核和c2 LTBhiCD4+T细胞增多，而原始EGR1+单核和c1 TCF7loCD4+T细胞减少（图2b-c,S6a），可见感染对恢复期的先天免疫和适应性免疫的细胞组成有显著影响。同时PI3+LDN在轻度中最高；CXCL10+和IFITM3hi单核细胞在中度最高 (图2c)，且高表达干扰素应答基因，表明中度恢复期固有免疫中持久的IFN应答状态。
4、恢复期单核细胞亚群存在IL-1β和IFN相关的两种免疫印记
作者进一步分析了WTA数据中48,181个单核细胞，发现经典的4群CD14+单核细胞是TOLL样受体刺激反应的主要群体(图3b)，其中EGR1+单核有最高的IL-1β信号响应潜力（图3c)，在健康供体中占比最高；另3群CD14+单核主要在恢复期，是应答性细胞，CXCL10+单核具高度IFN反应特征 (图3f)，CD14-CD16+单核也有IFN响应性。血浆中IL-1β水平与单核细胞中IFNGR1的表达也呈负相关。VNN2hi单核在粒状外源性抗原吞噬体、活性氧和TSP1途径的方面最优。
5、发现保护性新亚群PI3+中性粒细胞，恢复期LDNs也有IL-1β或IFN两种免疫印记
此前报导LDNs在COVID-19患者的急性感染中会异常增加，所以接下来作者分析了所有个体的LDNs(图4a)。发现了新的PI3+LDN亚群（图4b），在轻症中最多（图2c），PI3在炎症事件中能保护组织免受过度损伤，这可能是降低疾病程度的重要因素；PI3+等3群LDN有较高IL-1β炎症因子丰度（图4c)，MX1+LDN高表达许多IFN响应基因（图4d），不同亚群间的信号通路也有显著的差异（图4f）。
6、恢复期EGR1hi单核向CCL3hi单核的分化
基于EGR1在单核细胞发生过程中的必要作用，作者推测在健康供体中占主导的EGR1+单核可能是其他应答性单核细胞的前体。此前发现在严重急性COVID-19中有促炎CCL3+单核。本工作中发现恢复期中有少量CCL3+单核，而健康人EGR1+单核也高表达CCL3，但位置明显区分(图5a)，提示促炎EGR1loCCL3hi单核可能来自EGR1hiCCL3lo 单核，通过RNA速率分析单细胞数据发现确实如此 (图5b)，并通过其他分析(图5c)和体外实验得到验证。这表明了COVID-19患者全身炎症的潜在来源。
7、IFN反应性免疫细胞和细胞因子介导的COVID-19后遗症（PASC）
作者比较了有或没有PASC的恢复期样本中每个亚群的细胞数量。发现PASC外周血中有3群显著增加的细胞，与CD14+CXCL10+单核显著正相关；PASC样本血浆中异常升高CCL11和IL-4，与干扰素相关。表明PASC可能与IFN反应性单核细胞和细胞因子有关。
讨论
作者发现恢复期天然免疫细胞中单核细胞和低密度中性粒细胞均表现出IL-1β或IFN响应性的亚群。轻度患者康复期主要为IL-1β响应，中度患者康复期主要为IFN响应，不同响应性的免疫印迹指示了疾病的严重程度。EGR1+单核细胞向促炎CCL3+单核细胞的分化，揭示了患者炎症因子的潜在来源。
最振奋人心的是，作者首次鉴定了PI3+ LDN并阐明其在控制COVID-19的进展中发挥保护作用；VNN2hi单核细胞可抑制T细胞反应，其可能是减轻T细胞过度活化所介导的免疫损伤的重要机制之一，可能与轻度恢复期及时抑制抗病毒T细胞应答有关。PI3+LDN和VNN2hi单核细胞维持免疫应答的平衡，这可能对Omicron突破感染导致无症状到轻微临床症状至关重要。
单细胞多组学平台
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 单细胞多组学分析系统能够对成千上万个单细胞的蛋白与基因进行数字定量，提供灵活的定制化Panel及标准化应用方案，以满足不同的实验需求，其独特的混样技术可有效节约时间与成本。
系统组成包括：
BD Rhapsody™ 扫描仪
BD Rhapsody™ 上样台
BD Rhapsody™ cartridge（微孔板）
分子标签试剂和文库制备
全转录组检测试剂盒/靶向RNA检测试剂盒/定制试剂盒
Abseq蛋白检测试剂盒
多样本混样检测试剂盒
VDJ检测试剂盒
单细胞测序数据分析软件BD SeqGeq
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