离子交换层析的缓冲液和盐

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离子交换色谱通常至少会使用两种不同的缓冲液：一种用于蛋白质上样并洗去不吸附的杂质，称为起始缓冲液；另一种用于洗脱吸附在柱上的蛋白质，称为洗脱缓冲液。

达到最终pH和盐浓度的洗脱缓冲液称为极限缓冲液。这里又分为两种情况，在完成吸附后将目的蛋白洗脱下来有两种方法：一种是通过改变pH，使蛋白质的带电状态发生变化而不能结合在交换剂上，此方法会用到两种不同pH的起始和洗脱缓冲液；另一种是通过增加离子强度，虽然不改变蛋白质的带电状况，但高的离子强度会降低蛋白质与离子交换剂之间的静电引力，从而将蛋白质洗脱下来，此方法会用到两种pH相同而离子强度不同的缓冲液，通常极限缓冲液是向起始缓冲液中添加特定浓度的盐类而形成。

为了保证目的蛋白在吸附阶段能结合到交换剂上，起始缓冲液的浓度一般比较低，介于0.01-0.05mol/L。但过低的起始浓度有可能造成蛋白质在离子交换剂上吸附过于牢固而给洗脱造成困难，同时也应当控制吸附阶段的时间。研究显示，将蛋白质吸附在离子交换柱上过夜再进行洗脱，比直接进行洗脱明显困难，这是由于长时间的吸附会引发蛋白质的构象缓慢发生改变，这种改变使之与交换剂结合更为牢固，并且这种构象变化一般都会造成蛋白质活性下降。合适的起始缓冲液浓度可以通过小样试验确定。

在采用改变pH的方法洗脱时，洗脱缓冲液的缓冲成分种类往往与起始缓冲液相同，只是控制比例关系不同造成最终pH不同。洗脱缓冲液在浓度方面并没有特殊的要求，常与起始缓冲液相同。在采用增加离子强度的方法洗脱时，所用洗脱缓冲液在缓冲物质种类、pH和浓度上往往都与起始缓冲液相同，通常是通过向起始缓冲液中添加特定浓度的其他种类盐 （如NaCl）来增加离子强度。

所以，实际上无论是何种缓冲液，缓冲物质的浓度通常都不大，为了使其具有足够的缓冲能力，必须满足一定的条件。根据Henderson-Hasselbalch公式：

当缓冲液的pH接近缓冲物质的pK_a时，才具有良好的缓冲能力。最大缓冲能力出现在pK_a处，偏离pK_a值1个pH单位缓冲能力将下降5倍。一般来说，缓冲液的有效pH范围约为pK_a±2pH单位，而要获得足够强的缓冲能力，pH最好在pK_a±0.5pH单位之间。当弱酸（或弱碱）与对应的盐的物质的量之比接近1:1时，此缓冲体系的缓冲能力最强。所以在选择缓冲液时，首先应根据起始缓冲液所需要的pH，选择pK_a值与之接近的缓冲物质，使弱酸（或弱碱）与对应的盐的物质的量之比接近1。需要注意的是，缓冲物质的pK_a值是会随温度变化的，在温度相差较大时会对溶液pH产生明显的影响。例如，在室温下配制出的Tris缓冲液比在冷藏室（4℃）中的低0.05个pH单位。

采用增加离子强度的方法洗脱蛋白质时，通常选用某种非缓冲盐类，最常用的是NaCl，添加到起始缓冲液中，构成了洗脱缓冲液。在进行色谱分离时，洗脱缓冲液中的缓冲物质固然会影响到色谱效果，实际上非缓冲盐的种类和性质同样会影响到色谱时的分辨率和选择性，使用不同的非缓冲盐离子时，可能造成不同物质被洗脱的先后顺序发生变化，因此非缓冲盐的选择同样具有重要意义。

在前面离子交换理论部分讨论过，价态高的离子与交换剂的结合力更强，所以一般情况下，多价离子是比一价离子更好的置换离子，它们能使蛋白质比较早被洗脱下来 （保留值小）。所以在阳离子交换剂上，蛋白质的保留值与置换离子的关系为：Ba²⁺＜Ca²⁺＜Mg²⁺＜NH⁴⁺＜K⁺＜Na⁺＜Li⁺，但也存在例外，比如对于溶菌酶来说，NH⁴⁺是比Mg²⁺更有效的置换离子。在选择置换离子时，应当考虑到多方面的因素，强的置换离子能有效缩短色谱时间，但往往也降低蛋白质回收率。一般情况下选择置换能力居中的盐离子较为合适，在洗脱与交换剂牢固结合的蛋白质时，选用强的置换离子具有优势。

不但置换离子，洗脱盐中与功能基团带同种电荷而不参与离子交换过程的离子也会影响到蛋白质的色谱行为，原因也有多种。有些是因为离子与蛋白质发生作用导致的。此外，二价离子如Ca²⁺和Mg²⁺能与蛋白质分子中的酰胺基形成复合物而影响到其色谱行为。

总之，离子对色谱行为的影响是多方面的，没有一定的规律。在首次进行色谱分离时，可优先选择比较通用的一些缓冲物质和盐类，在此基础上再进一步优化。

在有些情况下，在进行离子交换时还会添加一些其他的化合物，其作用主要有：增加蛋白质的溶解度，提高色谱分辨率，保护待分离物质等。大多数蛋白质是溶于水的，但也有部分蛋白质疏水性比较强，在水中的溶解度很小，这使得色谱操作难于实现。具体例子是膜蛋白的分离。膜蛋白存在于生物膜中，其表面是疏水区，与生物膜中疏水性的脂质成分以疏水相互作用结合，这类蛋白在水中是不溶的或溶解度很低。向溶液中添加非离子型或兼性离子型去污剂可以使膜蛋白溶解并分散在水溶液中，便于色谱分析的进行。有机溶剂（如氯仿、甲醇等）也能增加疏水性蛋白质的溶解度，而且由于有机溶剂降低溶液的介电常数，使得蛋白质与交换剂之间的静电作用力更强，吸附更为牢固。

某些情况下，添加特定的物质还能提高色谱柱的分辨率。例如，在分离一些蛋白质时，添加甜菜碱或牛磺酸能减少蛋白聚集体的形成及其与交换剂的结合，从而提高了分辨率。有的中性聚合物如聚乙二醇（PEG）能与蛋白质竞争溶液中的水分子，这将增加蛋白质与离子交换剂的相互作用而提高分辨率。分离过程中有时还需添加酶抑制剂。例如在蛋白质分离过程中，样品体系中如果有蛋白酶存在，会造成目的蛋白被水解，使回收率下降，添加蛋白酶抑制剂能够有效保护目的蛋白。丝氨酸蛋白酶常用的抑制剂是苯甲磺酰氟，巯基蛋白酶常用的抑制剂是碘乙酰胺，金属蛋白酶可采用金属螯合剂作为抑制剂。

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