【知识分享】常温下的液相色谱：液相色谱方法何时应该设置准确的温度？

在反相色谱中，提高柱温通常会降低分析物的保留。在一个没有控制柱温的方法中，如果实验环境温度发生了变化，会出现什么问题？

在早期的液相色谱中，精准控制色谱柱温度并不是许多仪器设置中的首要考虑因素。不像气相色谱，柱温是决定保留的最重要的实验变量，在液相色谱中，柱温对于保留的影响相对流动相的组成来说要弱很多（也就是说，反相、亲水色谱HILIC中有机相和水相的比例，或基于电荷分离方法中阴离子和阳离子浓度的比例对于分析物保留的影响重要的多）。

随着大家对液相色谱中温度影响的认识在不断提高，例如，进一步了解了柱温对于不同类型分析物保留的影响（1），色谱柱入口处流动相温度与色谱柱温度匹配的重要性（2），以及色谱柱中热流对柱效的影响（3），精准控制液相色谱柱温度的需求也在不断的增加。越来越多的色谱工作者已经开始注意控制液相色谱仪的温度（仪器厂家也早已设计出了相应的仪器模块），并且在开发和验证方法的时候习惯明确规定一个温度值或者温度范围。然而，现在还是有很多在用的方法上标明的是“室温”条件，而且大多时候方法中所指的“室温”并没有一个明确的定义。这样就产生了一个很明显的问题：类似这样的方法，我们能否合理预期在阿拉斯加的安克雷奇和在印度的孟买能得到相同的分离效果？

在这期“液相色谱常见问题处理”中，我们将会讨论液相色谱中温度对化合物保留的影响的原理，并且以一些实验数据来帮助我们理解如果允许“室温”条件发生一些变化，将在什么情况下会严重影响化合物的分离。

在反相液相色谱中，柱温对化合物保留的影响通常可以通过Van’t Hoff定律来进行描述，如下所列的方程1：

k是分析物的保留因子，T是在这个k值下的温度。变量A是一个特定条件下参数，与分析物从流动相到固定相之间熵的传递和相比（固定相体积和流动相体积的关系）有关，变量B则与分析物从流动相到固定相之间焓的传递有关。图1显示了在C18色谱柱，乙腈水为流动相的条件下，几个中性小分子化合物在不同的温度下的保留数据。数据大致呈线性变化的趋势，如方程1所预测的一致。Weber团队通过大量的实验数据对此进行验证，得出结论是方程式1的非线性版本比线性版本能更好的贴合实验数据（1）。还有其他研究人员则提出了争议，认为数据呈现线性的表象更趋向于是一种巧合，而不是热力学的必然性。

图1中各直线的斜率与分析物从流动相到固定相之间焓的传递有关。对于化学结构类似的分子而言，这些斜率的数值相似，如图1a中的甲苯，乙苯和丙苯所示数据。对于这些结构类似化合物的分离，提高柱温能够减少分析物的保留，而不会对各峰之间的间距（也就是说选择性）产生太大的变化，因为所有的峰都是以差不多相同的速率朝一个方向移动。然而，对于一些带有不同官能团的化合物，斜率则会差异很大，如图1b中的对硝基氯苄和苯甲醚。在这类实例中，提高柱温会减少分析物的保留，但由于变化速率不同，因此选择性和分离度将会发生变化。极端的例子表明甚至还能导致洗脱顺序发生变化（5）。大家若有兴趣，可以简单通过下面网站提供的模拟装置进行尝试，在上面可以通过改变流动相组成和色谱柱温度，然后观察对保留和分离的影响(www.multidlc.org/hplcsim)。

在方法开发的过程中明确规定“室温”的条件，将有利于避免在方法执行的过程中出现问题，尤其是该方法需要到各个不同环境的实验室去得到执行，而这些实验室所处的室温环境各不相同。

在方法开发的过程中，柱温变化对方法影响的敏感程度，需要被列入方法稳定性的考察之中。

用恒温箱来控制色谱柱的柱温能够避免上述所有问题的发生，尽管是以增加了一个仪器模块作为代价。