J Pharm Anal （IF：14.026）| LC-MS和GC-MS两大质谱联用技术共同助力中药复方成分定性分析

鹿明生物

2023.5.29

作者欧易生物

TA的动态

武汉大学刘天刚教授课题组联合上海交通大学邓子鑫课题组在Journal of PharMaceutical Analysis期刊发表的题为 “Qualitative analysis of cheMical coMponents in Lianhua Qingwen capsule by HPLC-Q Exactive-Orbitrap-MS coupled with GC-MS”（IF：14.026）的研究成果，通过高效液相色谱-Q Exactive Orbitrap质谱（HPLC-Q Exactive Orbitrap MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）两大仪器分析方法，结合数据匹配分析，对连花清瘟胶囊中化学成分进行了鉴定分析，共鉴定表征包括：酚类、酚酸、苯丙烷类、醌类、萜类、挥发性成分（17种）以及其他类型化学成分共120种，并阐述了一些具有代表性成分（挥发性成分薄荷醇等在内）的裂解途径和特征片段。

这是第一份通过HPLC-Q Exactive Orbitrap MS和GC MS鉴定连花清瘟胶囊中主要化学成分的综合报告，本研究的结果可为连花清瘟胶囊的质量控制和标准化提供依据。

中文标题：高效液相色谱-质谱联用技术对连花清瘟胶囊中化学成分的定性分析

研究对象：中药复方—连花清瘟胶囊

发表期刊：Journal of PharMaceutical Analysis

影响因子：14.026

合作单位：武汉大学制药科学学院，上海交通大学生命科学与生物技术学院

运用生物技术：HPLC-Q Exactive Orbitrap MS和GC-MS两大质谱联用技术

研究背景

连花清瘟胶囊（LHQW）是一种为治疗SARS-CoV-1感染患者而开发的中成药。开发的基础源于两个古方：麻杏石甘汤和银翘散，组方包括：黄芪、甘草、金银花等11种中药材，在国内被广泛用于呼吸道严重感染的治疗。诸多研究表明LHQW具有抗H7N9和H7N1的作用，还有研究表明其对COVID-19也有疗效。LHQW已作为国健委员会发布的新冠肺炎诊疗指南的代表性中药处方。然而，LHQW的使用仅限于中国，为了使LHQW被全球接受，必须充分了解其化学成分和作用机制。因此，确定LHQW的化学成分是必要的，从而进一步实现其质量控制和标准化。

研究思路

实验设计思路参考流程图

研究材料和方法

1. 材料和方法

1.1化学品和材料：连花清瘟胶囊，乙腈、甲酸、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷等。

1.2样品准备：

LC-MS分析样品：LHQW胶囊原料药棕色粉末0.4 g，20ML的60%甲醇溶解，超声30 Min。12000 r/Min离心，取上清0.22 mm膜过滤。

GC-MS分析样品：1g的LHQW被10ML（正己烷、丙酮、乙酸乙酯）萃取剂超声20Min，12000 r/Min离心，取上清0.22 mm膜过滤。

1.3 HPLC-Q Exactive-Orbitrap-MS 分析：HPLC-HRMS; UltiMate 3000 HPLC仪器系统，采用aQ C18柱（2.1 mm*150 mm, 3 mm）柱温恒定40℃，流速0.2mL/min，进样量5uL。质谱是ESI离子源的Q Exactive-Orbitrap仪器系统，数据采集使用Xcalibur 4.1软件。两种扫描模式：全扫描（分辨率70000），DDA模式（分辨率17500，范围100-1500m/z）用于分析LHQW化学成分。

1.4 GC-MS分析：使用配有AS 3000自动采样器、分裂/无分裂注入器和三重四极杆的TSQ量子XLS质谱探测器的GC气相系统，色谱柱为TR-5 MS毛细管柱(30 mm*0.25 mm，0.25)。进样温度和离子源温度：250℃。电离能为70 eV。收集50-550m/z 扫描范围内的总离子图。数据采集使用Xcalibur 2.2软件。

1.5 数据处理和化合物鉴定：LC-QE-MS 获得的数据采用CD 3.0软件处理，提取ESI正、负模式的分子量、Rt、二级碎片和峰面积的数据矩阵，集成到CD软件中，将二级MS²数据与mzVault库对标。匹配得分大于85分（¼100分）采用。此外，结合文献报道进行比对，提高化合物鉴定的准确性。

研究结果

1. 1HPLC-Q Exactive-Orbitrap-MS分析

LHQW胶囊正负离子模式的基峰色谱如图1所示。利用库对齐方法，共鉴定出104种化合物，包括生物碱、黄酮类、酚类、酚酸、苯丙素、醌类、萜类和其他植物化学物（见表1）。结合以往的研究，已鉴定的化合物存在于LHQW配方使用的中药中。未发现绵马贯众植物的化学成分。几种特定化合物的化合物鉴定如下所述。

Fig 1. 使用HPLC-Q Exactive Orbitrap MS分析在（A）电喷雾电离（ESI）正模式和（B）电喷雾离子化负模式下分析连花清瘟（LHQW）胶囊的基峰色谱图。

表：LC-MS检测鉴定中连花清瘟胶囊的化学成分表

tR:保留时间；a该化合物的代表性保留时间。不止一个峰被鉴定为该化合物; b片段离子。Thero m/z：化合物的理论质荷比（m/z）。Exp m/z：化合物的实测m/z。FF：连翘；LJ：忍冬；EH：麻黄；AS：苦杏仁；IR：板蓝根；DC：绵马贯众；HH：鱼腥草；PH：广藿香；RR：大黄；RC：红景天；GR：甘草；MH：薄荷。

2. 黄酮类成分查尔酮B鉴定

化合物71的分子式为C₁₆H₁₄O₅，由m/z 285.0760处的[M-H]^-峰建立。对于查尔酮B，MS2光谱与先前报道的相似。MS2光谱和可能的破碎途径如图Fig S1A所示。在m/z 270.0530处的峰值表示[M-H-CH3] -的形成。m/z 150.0316处的碱基峰归因于羰基碳周围基团的裂解产生的片段，随后CH3单元的损失。在m/z 177.0189处产生峰值的片段如图Fig S1A所示。mzVault库的对齐结果(Fig S1B；评分89.9)，该化合物鉴定为查尔酮B，是甘草中存在的一种化学物质。

Fig S1：(A)ESI负模式下查尔酮 B的MS2光谱和可能的片段（黑色）。碎片（蓝色）的理论质荷比（m/z）。碎片（红色）的实验质荷比（m/z）。分子离子的结构（橙色）。(B)在ESI负模式下，查尔酮 B的实验MS2光谱(Top)和参考MS2光谱之间的比较（Bottom：来自mzVault库）。发现与可能的片段相对应的峰与来自mzVault文库的峰一致（红色）。

3. 萜类化合物獐牙菜苷鉴定

化合物26的分子式为C₁₆H₂₂O₉，由m/z 359.1335处的分子离子峰（[M+H]⁺）表示。mzVault库的对齐结果(Fig S2B；评分96.2)，该化合物鉴定为獐牙菜苷，是金银花中的一种化学物质。

Fig S2：(A)在ESI正离子模式，sweroside的MS2光谱和可能的片段（黑色）。

4. 醌类化合物大黄素鉴定

化合物97的分子式为C₁₅H₁₀O₅，由m/z 269.0454处的[M-H]^-峰建立。mzVault库的对齐结果对齐(Fig S3B；评分96.8)，结合文献资料比较，确认该化合物为大黄素，是大黄中的化学物质。

Fig S3：(A)ESI负离子模式下大黄素的MS2光谱和可能的片段（黑色）。

5. 酚酸化合物没食子酸乙酯鉴定

化合物31的分子式为C₉H₁₀O₅，从MS²光谱中m/z197.0451（[M-H]^-）处的分子离子峰表示（Fig S4A)。与文献数据和库对齐(Fig S4B）比对，化合物31为没食子酸乙酯，是红景天植物中的一种成分。

Fig S4：(A)ESI负离子模式下没食子酸乙酯的MS2光谱和可能的片段（黑色）

6. 苯丙素类化合物连翘苷鉴定

化合物75的质谱中m/z 579.2079处的峰属于[M+HCOO]-加合物，而m/z 533.2019处的峰对应于[M-H]^-。在MS2光谱中，特征峰分别为m/z371.1490、356.1250和121.0288。库对齐（Fig S5B）和与文献数据的比较表明，化合物75是连翘苷，连翘中的一种化学物质。可能的片段化途径和特征片段如Fig S5A所示。

Fig S5：(A)连翘苷在ESI负离子模式下的MS2光谱和可能的片段（黑色）。

7. 酚类化合物红景天苷鉴定

化合物17的MS²光谱中m/z 299.1133处的峰归属于[M-H]^-离子。一些特征峰和相应的片段位于m/z 137.0605（[M-H-Glc]^-）和m/z 119.0496（[M-H-Glc-H2O]^-），数据与先前的研究一致。可能的裂解途径如图S6A所示。库对齐（Fig S6B；得分96.6）将该化合物鉴定为红景天苷，一种红景天中的化合物。

Fig S6：(A)ESI正离子模式下红景天苷的MS2光谱和可能的片段（黑色）

8. 生物碱类化合物腺嘌呤鉴定

化合物7的分子式为C₅H₅N₅。MS²光谱中只有两个特征峰（图S7A）：m/z 136.0619（[M+H]⁺）和m/z 119.0356（[M+H-NH3]⁺）。与文献数据和库对齐结果的比较（Fig S7B）表明，化合物7是腺嘌呤，一种板蓝根中的生物碱。

Fig S7：(A)ESI正离子模式下腺嘌呤的MS2光谱和可能的片段（黑色）。

9. 苦杏仁苷鉴定

化合物22具有C₂₀H₂₇NO₁₁的分子式，如m/z 458.1675（[M+H]⁺）和m/z 475.1922（[M+NH4]⁺）处的峰所示。m/z 296.1129处的峰归因于[M+NH4-Glc]⁺，其他特征片段以及可能的片段化途径如Fig S8A所示。可能的裂解途径与参考文献的比较，以及ESI（-）模式下保留时间的库对齐（图S8B）表明，化合物22是苦杏仁苷，是苦杏仁中的化学成分。

Fig S8：(A)ESI正离子模式下苦杏仁苷的MS2光谱和可能的片段（黑色）。

10. GC-MS分析

三种提取物的总离子色谱图（TICs；Fig S9）相似。在乙酸乙酯中提取的LHQW胶囊的TIC如Fig 2所示。通过将获得的数据与NIST质谱库和先前报道的文献中的数据进行比较，总共鉴定出17种挥发性化合物（表2）。结果表明，用峰面积归一化法计算，主要成分为薄荷醇，相对百分比为97.89%。其他最丰富的成分是广藿香醇（0.47%）等。这里大多数成分是从薄荷和广藿香中提取的萜类化合物。据Kiyohara等人报道，广藿香醇具有抗病毒和抗炎活性。

Fig S9：通过用不同溶剂提取的LHQW胶囊的GC-MS分析获得的总离子色谱图（TICs，4-25分钟）的放大图像。（A）乙酸乙酯、（B）正己烷、（C）丙酮。MH：薄荷脑；PH：广藿香。

研究结论

在本研究中，首次使用HPLC-Q Exactive Orbitrap MS结合GC-MS方法来鉴定LHQW胶囊中该化学物质。LHQW是一种用于治疗严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染的症状的中成药。此外，发现MS和MS²光谱库对齐方法是快速识别复杂混合物成分的一种方便方法。本研究共成功检测并鉴定了生物碱、黄酮类、酚类、酚酸、苯丙类、醌类、萜类等120种成分。

本研究结果有助于进一步研究LHQW胶囊的活性化学成分及其作用机制，可为LHQW胶囊的质量控制和标准化提供依据。

文章推荐

1.这是第一份通过HPLC-Q Exactive Orbitrap MS和GC MS鉴定连花清瘟胶囊中主要化学成分的综合报告；

2.采用了液质和气质两大质谱联用技术，结合文献及库对齐方式实现对化合物的快速鉴定；

3.中药复方成分鉴定分析的经典案例之一。

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参考文献

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