2023年7月3日，上海交通大学医学院附属第九人民医院曹巍教授团队和上海交通大学医学院赵旭赟研究员课题组合作在Advanced Science (IF=15.1) 在线发表了题为“Yin Yang 1-Induced Long Noncoding RNA DUXAP9 Drives the Progression of Oral Squamous Cell Carcinoma by Blocking CDK1-Mediated EZH2 Degradation”的研究论文。该研究报道了一个新的在口腔鳞状细胞癌中高表达的lncRNA——DUXAP9，并通过一系列研究揭示了DUXAP9在翻译后水平诱导EZH2表达的新机制，从而驱动口腔鳞状细胞癌的发生和发展，为口腔鳞状细胞癌治疗提供了新的潜在靶点。
发表期刊：Advanced Science
影响因子：15.1
涉及的欧易生物服务产品：affymetrix OE lncRNA芯片
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一种具有侵袭性表型的高异质性肿瘤。近年来研究发现lncRNAs在OSCC的进展中起着关键作用。然而，大多数lncRNAs在OSCC中的功能和详细的分子机制尚不完全清楚。EZH2是PRC2的催化亚基，是一种高度保守的组蛋白甲基转移酶，是基因转录调控的抑制因子。之前的研究表明EZH2是OSCC患者一个独立的预后指标。然而，lncRNA翻译后调控EZH2在OSCC进展中的潜在机制仍有待全面阐明和进一步研究。
本研究发现了一个新的lncRNA——DUXAP9，它在OSCC组织中显著上调，并且与OSCC患者的生存率密切相关。而Yin Yang 1 (YY1)可激活DUXAP9在OSCC中的转录表达。并且DUXAP9通过抑制EZH2磷酸化而抑制EZH2降解，从而阻断EZH2从细胞核向细胞质的转位。
Result1 DUXAP9是一种在OSCC中高表达的核定位lncRNA，与患者不良的临床病理特征相关
为了确定OSCC中显著上调的lncRNAs，首先在5对OSCC和相应的邻近正常组织中进行lncRNA芯片检测，结果显示DUXAP9在OSCC中显著高表达，经预测发现其缺乏编码能力。为了验证DUXAP9在癌症中的表达，使用TCGA数据库进行了泛癌分析，发现DUXAP9在5个OSCC细胞系中表达上调。RNAscope检测也显示DUXAP9在OSCC肿瘤组织中富集。qRT-PCR检测了90个配对的OSCC样本及邻近正常组织，DUXAP9在OSCC组织中的表达高于邻近正常组织。这些结果表明，DUXAP9可能在OSCC的发生发展中起致癌作用。
接着研究了DUXAP9在口腔鳞癌中的临床相关性， 其显著高表达与病理分化差、临床晚期、淋巴结转移、差的总生存率和疾病特异性生存率相关。同时，对DUXAP9进行亚细胞定位研究，结果表明DUXAP9主要在细胞核中表达，提示DUXAP9可能在细胞核内发挥其生物学功能。
图1.DUXAP9是一种核lncRNA，在OSCC患者中高表达，与临床病理特征呈正相关
Result2 DUXAP9促进OSCC细胞增殖、侵袭和转移
实验结果显示，体外敲低DUXAP9基因可抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭；上皮-间质转化（EMT）标志物N-cadherin、Vimentin、TWIST、SNAIL和SLUG在DUXAP9敲低后减少，Ecadherin增加。而过表达DUXAP9则产生了与上述相反的结果。
接下来检测了DUXAP9在体内调控肿瘤发生中的表达。与对照组相比，DUXAP9敲低组的小鼠肿瘤体积和重量明显减少，肿瘤的Ki67、PCNA和EZH2染色较弱。而过表达DUXAP9后观察到了相反的结果。这些结果进一步证实了DUXAP9在促进肿瘤形成中的关键作用。并探究了DUXAP9是否影响OSCC细胞的转移，观察到DUXAP9过表达的报告细胞比载体对照细胞更多地转移到裸鼠的肺部并且在肺部形成更多的肿瘤结节。
图2.敲低DUXAP9基因抑制OSCC细胞的生长、迁移和侵袭（左图）
图3.DUXAP9过表达可促进OSCC细胞的体外生长、迁移和侵袭（右图）
图4.DUXAP9促进OSCC细胞癌移植瘤生长和转移
Result3 YY1能够激活OSCC细胞中DUXAP9转录表达
为了寻找在OSCC中可能调节DUXAP9上调的转录因子。使用数据库预测结合DUXAP9启动子区域的TF，发现了两个转录因子RXRA和YY1。并进一步发现只有YY1与DUXAP9具有显著的表达正相关。敲低OSCC细胞中YY1基因抑制了DUXAP9的表达；而过表达YY1则有相反的结果。
进行染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶分析验证YY1与DUXAP9启动子的结合位点，结果表明，YY1高度富含在DUXAP9启动子区域的−90-100bp区域。并且在OSCC细胞中，YY1结合基序相邻的pgl3-P2荧光素酶报告被显著激活；DUXAP9启动子8~23bpMotif2突变的荧光素酶活性明显低于对照。
此外，还研究了YY1在OSCC中的临床相关性。YY1在OSCC中的表达高于癌旁正常组织，并且其显著高表达与临床晚期、淋巴结转移相关。综上结果表明YY1在转录水平上调节OSCC细胞DUXAP9的表达。
图5.YY1转录激活DUXAP9表达
Result4 DUXAP9与EZH2的直接相互作用
接下来探讨DUXAP9调控口腔鳞癌发生的机制。在OSCC细胞中鉴定到32个蛋白质定位于核质中，是DUXAP9结合的候选者。之前的靶向药物筛选发现EZH2是口腔鳞癌进展的关键调节因子。通过RIP-qPCR以及RNA pull-down证实了DUXAP9物理上与EZH2结合。共聚焦显微镜显示DUXAP9和EZH2在OSCC癌细胞核内共存，并且DUXAP9具有很高的蛋白质-RNA相互作用倾向。利用重组EZH2蛋白和体外转录的野生型和突变型DUXAP9 RNA进行的体外重组RIP实验进一步证实了DUXAP9与EZH2的直接相互作用，表明DUXAP9碱基对1114-1165nt上的核苷酸可能是EZH2的主要结合部位。
图6.OSCC细胞中DUXAP9和EZH2的物理相互作用
Result5 DUXAP9通过抑制蛋白酶体介导的降解提高EZH2蛋白的稳定性
下面研究DUXAP9是否调节EZH2的表达水平，结果发现DUXAP9正向调节EZH2的蛋白水平，但不能调节EZH2的mRNA水平，表明DUXAP9可能在翻译后调节OSCC细胞中EZH2的表达。接着进一步阐明DUXAP9上调翻译后EZH2表达的机制，发现DUXAP9的表达促进了EZH2的稳定性。在OSCC细胞中，用蛋白酶体抑制剂MG132处理后，由于SS-DUXAP9转导而导致的EZH2表达下降完全被挽救。而MG132在对照细胞中增加了EZH2的表达，但在DUXAP9过表达的细胞中没有增加。表明DUXAP9通过抑制蛋白酶体的降解来增加EZH2蛋白的表达。EZH2的免疫沉淀和抗泛素免疫印迹表明，在SS-DUXAP9过表达的细胞中，泛素化的EZH2显著增加，而在DUXAP9过表达的细胞中，EZH2泛素化显著降低。因此，DUXAP9抑制OSCC细胞中EZH2的泛素化和蛋白酶体降解，并导致EZH2表达上调。
图7.DUXAP9通过抑制蛋白酶体降解促进EZH2蛋白表达
Result6 DUXAP9通过抑制EZH2的磷酸化和核质转位抑制EZH2的降解
据报道，CDK1介导的EZH2在Thr345和Thr487处的磷酸化是泛素化和随后通过泛素-蛋白酶体途径降解所必需的。后续实验证实了在CDK1过表达的细胞中，磷酸化的EZH2(Thr345/487)和泛素化的EZH2升高。对DUXAP9进行敲低和过表达；发现在OSCC细胞中，敲低DUXAP9显著增加了Thr345/487磷酸化的EZH2，而过表达DUXAP9则相反。同时DUXAP9的过表达显著抑制了EZH2和CDK1之间的相互作用。随后等一系列结果表明，DUXAP9通过抑制CDK1介导的EZH2的磷酸化和泛素化，阻断EZH2从细胞核向细胞质的易位，从而抑制EZH2的降解。
图8.DUXAP9通过抑制EZH2的磷酸化抑制EZH2的降解
图9.DUXAP9通过核质易位抑制EZH2降解
Result7 DUXAP9以EZH2依赖的方式促进OSCC细胞的增殖和侵袭
接下来确定DUXAP9是否通过调节EZH2的表达和EZH2相关的PRC2复合体活性来促进OSCC的发展。qRT-PCR结果表明，在EZH2过表达和DUXAP9过表达的细胞中，9个已知的EZH2靶基因的表达均降低，提示DUXAP9通过EZH2的表达发挥作用。进一步发现DUXAP9可能通过调节PRC2复合体活性来调控EZH2靶基因。实验结果发现，敲低DUXAP9减少了EZH2与其靶基因的结合，这表明在敲低DUXAP9细胞中，PRC2复杂功能受到了损害。敲低EZH2显著减少了由过表达DUXAP9的OSCC细胞形成的肿瘤的体积和重量，并降低了Ki67、增殖细胞核抗原和EZH2蛋白的表达水平。这些结果显示了DUXAP9以EZH2依赖的方式诱导OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。
图10.DUXAP9通过介导EZH2的表达和功能促进OSCC细胞的增殖和侵袭
本研究发现了一个新的在OSCC中高表达的核定位lncRNA——DUXAP9，在体内外促进OSCC细胞的增殖、侵袭和转移。DUXAP9被YY1转录激活，并通过直接与EZH2结合来抑制CDK1介导的EZH2在T345和T487的磷酸化和泛素化，从而抑制其蛋白酶体降解的核质转位。总之揭示了DUXAP在翻译后水平诱导EZH2表达的新机制，从而驱动OSCC的发生和进展，提示DUXAP9可能是OSCC治疗的潜在靶点。
图11.YY1诱导的DUXAP9通过阻断CDK1介导的EZH2降解来驱动OSCC
参考文献
Zhou W, Feng Y, Lin C, Chao CK, He Z, Zhao S, Xue J, Zhao XY, Cao W. Yin Yang 1-Induced Long Noncoding RNA DUXAP9 Drives the Progression of Oral Squamous Cell Carcinoma by Blocking CDK1-Mediated EZH2 Degradation. Adv Sci (Weinh). 2023 Jul 3:e2207549. doi: 10.1002/advs.202207549.
往期推荐
项目文章 | 单细胞转录组分析揭示了亚硝酸盐胁迫对对虾血细胞的毒性机制
项目文章 | 益生元对亚洲象肠道疾病的治疗机制
项目文章 | 转录组和单细胞转录组测序助力解析衰老过程中衰老免疫细胞的积累与棕色脂肪组织功能障碍的相关性
项目文章 | 较大的昼夜温差改变肠道菌群，加剧肌肉萎缩
首页
