Tunnel实验原理

　　Tunnel 检测(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay)：即原位末端转移酶标记技术，凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3′-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而进行凋亡细胞的检测。

　　实验原理：细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT) 的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

　　实验器材与试剂

　　1、器材：光学显微镜及其成像系统、摇床、组化笔、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的移液器及枪头等。

　　2、试剂：试剂盒含TdT 2×、Biotinylated标记的dUTP、标记streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×等

　　实验内容与方法

　　1、标本预处理：

　　石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)各2min，下行至95%、80%、70%、50%酒精各5min。将组织切片放入0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)并在微波炉里加热至沸腾后，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。然后用蒸馏水洗。

　　2、用PBS洗两次，每次5min。 用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加TdT酶缓冲液，置室温1～5min。

　　3、 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 50μl TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应 1hr(注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液)。

　　4、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。

　　5、 组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗体，于湿盒中室温反应30min。

　　6、用PBS洗3次，每次5min。

　　7、在组织切片上直接滴加新鲜配制的50~100μl DAB溶液，室温显色3～6min。

　　8、用PBS洗3次，每次5min, 苏木精复染2min，自来水清洗片刻。

　　9、 用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

　　实验周期：1-2周

　　实验完结提交：拍照图片，切片，包埋块，完整详尽实验报告，图片阳性率分析。