对**疾病转录组数据进行深度挖掘，筛选疾病组异常表达的 mRNA、lncRNA和 miRNA，构建**疾病相关的 ceRNA 网络，并结合临床数据获得潜在的预后分子靶标。
1、数据获取
从公共数据库下载或源于客户测序数据的 miRNA-Seq、lncRNA-Seq 和临床数据。

2、差异基因识别
     首先对数据中低量表达的基因进行剔除（过滤 raw count 80%以上为 0 的基因）。筛选有癌与癌旁配对组织的样本作为对象，进行差异分析。
     分别使用R包 edgeR）对 lnc、mRNAmiRNA 数据进行预处理，将 raw count 标化为 log-CPM 值，进行线性建模，并且使用由 voom 函数计算的精度权重来调节平均方差关系。
     使用 limma 包提供的线性回归和经验贝叶斯方法，分别对 mRNA、lncRNA和 miRNA 数据 Tumor VS Normal 进行差异表达分析。所有基因经过得到相应的P.Value 值，使用 Benjamini & Hochberg方法进行多重检验校正，得到校正后 p值即adj.P.Value。本研究中 mRNA、lncRNA 和 miRNA 差异表达阈值均为adj.P.Value < 0.05 且|log2FC| > 2。
     利 用 R 包 pheatmap （ Version: 1.0.8,https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap）对差异mRNA、lncRNA和miRNA数据进行层次聚类热图绘制，两点距离为欧几里德距离，聚类方法为single-linkage clustering。

3、 功能、通路富集分析利
    用 R 包 clusterProfiler 的GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）富集方法，对 mRNA 表达谱数据进行KEGG pathway 分析。GSEA 方法关注的是基因在全局中的变化情况，通过计算富集分数（Enrichment Score）、富集分数的显著性、多重检验校正等，得到些基因的生物特性、基因调控网络之间的关系。显著富集的阈值为 p.value < 0.05。
     使用 DAVID在线工具对差异表达mRNA 进行 GO[10]富集分析，结果包括 BP（Biological Process）、CC（Cellular Component）、MF（Molecular Function）。方法为精确 Fisher 检验，显著富集的阈值为 p.value < 0.05。

4、 蛋白质相互作用网络
     我们以 mentha、BioGRID（Version：3.4，https://wiki.thebiogrid.org/）、HPRD（Release 9，http://www.hprd.org/）三个数据库中的人类蛋白-蛋白相互作用关系，取三者交集作为背景，在其中匹配上一步得到的差异 mRNA，获得差异基因的蛋白相互作用关系（PPI）。
     通过上一步得到的 PPI 关系对之后，使用 Cytoscape 软件的 CytoNCA插件进行节点网络拓扑性质分析，参数设置为 without weight。计算每个节点的连接度（Degree），通过其得分排名得到 PPI 网络中参与蛋白互作关系的重要节点，即 hub 蛋白。
     利用 Cytoscape 软件的 MCODE 插件，在蛋白互作网络中，通过应用聚类分析进行功能模块识别，得到网络拓扑结构和网络组件间相互关系，最终获得有生物学意义的蛋白质复合体或功能模块。参数：Include Loops: false Degree Cutoff: 10，Node Score Cutoff: 0.2，Haircut: true，Fluff: false，K-Core: 2，Max. Depth from Seed: 100。利用 DAVID 工具对模块中的基因进行 GO-BP 和 kegg pathway富集分析，显著富集阈值为 p.value < 0.05。