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价格:
8000
多克隆抗体制备服务
产品属性
品牌
研谨生物
产地
上海
型号
多克隆抗体制备服务
关注度
0
信息完整度
关闭
产地:上海; 品牌:研谨生物
上海研谨生物科技有限公司
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单克隆抗体制备服务
产品描述
服务名称
:
多克隆抗体制备服务
提供商
:
上海研谨
生物
规格
:
实验
代做
服务
价格:
8000
元
收费标准
/
服务周期
/
提供结果
:
欢迎咨询详谈,我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。
更多实验技术服务请浏览网站其他内容
,
或来电详询
!
多克隆抗体制备服务
多抗一般制备流程
:
完全抗原的准备
- +
兔子的免疫
-→
效价检测和终放
- +
抗体亲和纯化
- +
抗体的浓缩和保存。
具体实验步骤如下
:
1.
兔子的准备
挑选健康的
6
周大小的新西兰大白兔两只
(
约
2Kg)
,使其适应新的生活环境,至少稳定几天再进行首次取血、预采血
(
作阴性参照用
)
1.1
将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静
;
1.2
小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见
(
也可不剃
);
1.3
如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位使血管膨胀
;
1.4
用注射器从耳静脉抽取约
10ml
血液
(
约
5ml
血清
);
1.5
小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口
;
1.6
将收集的血液置于
37 C
灭活
30min,
最后置于
4" C
过夜使其凝结释放血清
;
1.7
将凝结好的血液在
10000r / min
离心
10min; h.
收集 上清,即为血清。
兔子的免疫
2.1
注射两只兔子的抗原为
1ml,
抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂每只兔子初次免疫
400ug
抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果,后续免疫每次为
100ug
即可。
2.2
将
1m
的佛氏完全佐剂与准备好的
1m
抗原充分混匀,呈乳白色
; .
2.3
小心从笼中取出兔子
,
织兔子免疫
4
个部位
(
背部和大腿根部均可
)
,每个部位
250ul,
针头呈
45
度角插入皮下
1-2cm,
注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4
兔疫周期为
20
天,免疫完后
7-10
天取血
(
包括中途测试取血和最终放血
)
,总共免疫
4-5
次。
3.
效价检测
3.1 2
个参照阴性参照为预取血血清,均以
1
抗起始浓度稀释
(
封闭稀释液
);
阳性参照为以前
阳性血清
3.2
于
96
孔板中每孔滴加
100ul, 1ug/m
抗原,于
49C
过夜, 也可以
37°C
孵育
2
小时。
3.3
倒掉抗原溶液,每孔加入
200u
的封闭液,
49C
过夜或者
379C
孵育
2
小时。
3.4
倒去封闭液,在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间
, 37°C
烘干并用封口袋封好于
20°C
存放。
3.5
取包被好的
96
孔板,
第
---
孔加入阴性
参照液
100ul,
第二孔加入阳性参照液
100ul,
第三孔加入
1:500
的待测抗血清,后续各孔在此基础上倍比稀释
,
于
37°C
孵育
1
小时。
3.6
倒掉液体,用洗涤液洗板三次
,
拍干。每孔加入
100u
的
HRP
标记的小鼠抗兔
lgG (1: 2000
稀释
)
,于
37°C
孵育
45
分钟。
3.7
倒掉液体,用洗涤液洗板三次,拍干。每孔加入
100u
的
TMB
底物
(Sigma
单组份
TMB ) 37°C
孵育
5-20
分 钟
(
根据颜色深浅来决定显色的时间
)
。
3.8
每孔加入
50u
的终止液
(2N H2SO4)
, 在酶标仪上读取波长
450nm
处的吸光值。
抗体效价检测达到
100
万以上后可以对兔子进行终放血。
抗体的纯化
4.
抗体的亲和
--
亲和柱的制备
4.1
称取
1mg CNBr- Sepherose 4B
的琼脂糖凝胶加入
2mmol/ L
的盐酸中,
4" C
过夜使其充分溶涨,可获得
3m
溶涨胶。
4.2
将凝胶转移入纯化柱中,用约
20ml 2mmol / L
的盐酸洗介质
3
次。
4.3
用偶联缓冲液洗介质
- -
次,因为活化基团在偶联缓冲液
PH
值下易水解,所以此步骤
zui
好
在几分钟内完成。
4.4
将溶解在
5ml
偶联缓冲液中的
5-10mg
的抗原加入凝胶中
4.5
室温下轻轻混合摇动
2-4
小时,或
4" C
过夜
,
如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用
20ml
的偶联缓冲液洗介质一
-
次。
4.6
加入
15m1 1% BSA
溶液室温下孵育
2
小时或
4" C
过夜。
4.7
用磷酸盐缓冲液洗涤介质
3
次以上
,
每次
15m
以上
h.
4.8
抗原固相化完成,可用于纯化。
4.9
若不立即使用或者使用后,用
20%
的乙醇封存。
5.
抗血清的纯化和保存
5.1
抗血清用
PBS
等体积稀释,
5000-10000 / min
离心
15
分钟,取上清
.
5.2
用
10
倍体积的
PBS
清洗抗原亲和柱以平衡柱子。
5.3
将稀释好的抗血清
10m
加入平衡好的柱子中。
5.4
室温下轻轻混合摇动
2-4
小时,或
4" C
过夜
5.5
用
10
倍体积的
PBS
清洗抗原柱,以洗去结合在柱子上的杂蛋白
5.6
用
2
倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子,以得到特异性抗体
5.7
用
10
倍体积
PBS
平衡柱子
5.8
用
20%
的酒精封存柱子,
4'C
保存。
在得到洗脱的抗体后,经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于
PBS
中透析除盐,使用紫外可见分光光度计在波长
280nm
处测定抗体
OD
值,所得
OD
值除以
1.35
即为所测抗体的浓度,添加
40-50%
甘油置于
20^C
可长期保存。
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