载体构建- 目的基因过表达载体的构建
病毒包装- 表达载体、辅助质粒共转染293FT细胞,收集病毒上清,纯化和浓缩病毒颗粒。若选择转染,则跳过此步。
转染、转导- 电转染或转染试剂(脂质体等)进行细胞转染,或病毒转导。
筛选- 根据表达载体的筛选基因选择药物进行筛选,如嘌呤霉素、G418等。
扩大培养- 将筛选出的单克隆细胞进行扩大培养。
鉴定- PCR、Q-PCR、western等从DNA、mRNA、蛋白水平进行检测。
目的基因合成 | 1-2周 | 测序报告 |
目的基因亚克隆 | 3-5日 | 冻干粉质粒、含重组质粒的甘油菌一管、测序报告 |
病毒包装 | 1-2周 | 病毒储存液(>10^8 PFU)、重组后的病毒载体质粒 |
阳性克隆筛选 | 2-3周 | 用于筛选的药物浓度 |
阳性克隆鉴定 | 3-5天 | 阳性细胞株、测序报告、Q-PCR、western检测结果 |