T/YNRZ 019-2024
珠芽黄魔芋组培种苗生产技术规程
Technical regulations for the production of Amorphophallus spp. seed in tissue cultureTechnical regulations for the production of Amorphophallus spp. seed in tissue culture
- 标准号
- T/YNRZ 019-2024
- 发布
- 2024年
- 发布单位
- 中国团体标准
- 当前最新
- T/YNRZ 019-2024
- 适用范围
- 1 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 2 培养基母液的配制 2.1 母液的配制方法和保存 试剂配制严格按照GB/T 603规定方法配制，所用水执行GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法标准。通常将常用试剂配制成比培养基所需浓度高10倍～100倍的母液，母液置于4℃的冰箱中贮存。 2.2 大量元素母液的配制 分别称取硝酸铵33 g、硝酸钾38 g、磷酸二氢钾3.4 g、七水硫酸镁7.4 g、二水氯化钙8.8 g，分别加少量蒸馏水在不同的容器内充分溶解，用玻璃棒搅拌促溶解，定容至1000 ml容量瓶，置棕色广口瓶中保存，贴上标签。 2.3 微量元素母液的配制 分别称取碘化钾0.166 g、硼酸1.24 g、四水硫酸锰3.38 g、七水硫酸锌1.72 g、二水钼酸钠0.05 g、五水硫酸铜0.005 g、六水氯化钴0.005 g，可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解定容至1000 ml容量瓶，置棕色广口瓶中保存，贴上标签。 2.4 铁盐母液的配制 称取乙二胺四乙酸二钠7.46 g和硫酸亚铁5.56 g，分别溶于450 ml蒸馏水中，加热，不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000 ml，置棕色广口瓶中保存，贴上标签。 2.5 有机母液的配制 分别称取烟酸0.05 g、VB?0.01 g、VB?0.05 g、甘氨酸0.2 g，混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解定容至1000 ml容量瓶，置棕色广口瓶中保存，贴上标签。 3 培养基生长调节剂的配制 3.1 NAA的配制和保存 称取NAA 0.1 g，先用少量95%乙醇或无水乙醇完全溶解，定容至1000 ml容量瓶。 3.2 6-BA的配制 称取6-BA 0.1 g，先用少量95%乙醇或无水乙醇完全溶解，定容至1000 ml容量瓶。 3.3 KT的配制和保存 称取KT 0.1 g，先用少量95%乙醇或无水乙醇完全溶解，定容至1000 ml容量瓶。 3.4 TDZ的配制和保存 称取TDZ 0.1 g，先用少量95%乙醇或无水乙醇完全溶解，定容至1000 ml容量瓶。 4 培养基制备 4.1 制备方法 培养基由试剂、蔗糖、琼脂、水组成，蔗糖和水应分别符合GB/T 317和GB 5749规定，试剂配制严格按照GB/T 603规定方法配制，所用水执行GB/T 6682分析实验室用水规格。 4.1.1 称量 称取所需量的琼脂和蔗糖单独放入烧杯中，加入少量的蒸馏水，搅拌让其溶化。 4.1.2 配制 依次把称取好的母液及生长调节剂倒入已溶化的琼脂中，加入蔗糖，置于电磁炉上加热，不断搅拌，直至琼脂和蔗糖完全溶解最终定容到所需体积。 4.2 pH值调整 培养基最佳pH值为5.8，采用酸度计或精密pH试纸测定，通常用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCL来调节。 4.3 培养基分装 配制好的培养基需趁热分装，分装量以培养容器体积的1/4～1/3为宜，分装后应立即密封。 4.4 培养基灭菌 培养基分装后在24 h内完成灭菌工作，在压力为0.105 MPa，温度121℃的条件下，灭菌25 min～30 min。 4.5 培养基保存 灭菌后的培养基应保存于洁净、干燥的培养基储存室中，2℃～4℃条件下7 d内使用。 5 接种 5.1 外植体的选择 选用无病虫害、健壮的珠芽为外植体。 5.2 外植体的消毒 珠芽应先去皮，用自来水冲洗30 min，将洗净后的珠芽转至超净工作台上，用75%乙醇浸泡10 s～20 s，用无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞消毒12 min，最后用无菌水冲洗5次～7次后备用。 5.3 外植体的接种 在超净工作台上，将消毒后的珠芽黄魔芋珠芽切成约0.5 cm×0.5 cm的小块，接种到初代培养基上，切口接触培养基，接种后做好标记。 6 培养 6.1 培养条件 珠芽黄魔芋最适宜的培养温度为26℃，光照强度为2000 Lx，光照时间为10 h/d。 6.2 初代培养 6.2.1 初代培养基 珠芽黄魔芋组培快繁技术中诱导培养基为MS+TDZ 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+肌醇0.1 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L。 6.2.2 初代培养基条件 接种好的培养瓶放置在培养架上，培养30 d～50 d形成愈伤组织或丛生芽。丛生芽和愈伤组织继续培养或者转接，培养30 d左右，形成完整组培苗。 6.3 增殖培养 6.3.1 叶片培养 将无菌组培苗浓绿厚大的叶片切成大小约0.5 cm×0.5 cm小块，叶面朝上平铺于培养基上，培养周期30 d～50 d，形成愈伤组织和丛生芽。 6.3.2 叶柄培养 将无菌组培苗生长健壮的叶柄切成约1 cm的小段，扦插于培养基上，培养周期30 d～50 d，形成愈伤组织和丛生芽。 6.3.3 叶柄和叶片继代增殖培养基 叶柄和叶片继代增殖培养基为MS+TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.4 mg/L+6BA 1.0 mg/L+肌醇0.1 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L。 6.3.4 愈伤组织培养 将剪掉叶片和叶柄的愈伤组织分割成约大小0.5 cm×0.5 cm，转接到叶柄和叶片继代增殖培养基上，培养周期30 d左右，形成无根苗。 6.3.5 愈伤组织培养基 愈伤组织继代增殖培养MS+KT 0.9 mg/L+NAA 0.2 mg/L+肌醇0.1 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L。 6.4 生根培养 6.4.1 生根培养条件 丛生芽或无根苗转接至生根培养基上，培养周期15 d左右，形成完整的组培苗。 6.4.2 生根培养基 生根培养基为MS+IBA 1.0 mg/L+肌醇0.1 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L。 7 炼苗移栽 7.1 炼苗 在室温、自然光下，选择株高3 cm～5 cm的组培苗，先拧松瓶盖放置2 d～3 d，再半揭瓶盖放置2 d～3 d，最后完全揭开瓶盖放置3 d～5 d后即可进行移栽。 7.2 移栽驯化 从瓶中取出经过炼苗的组培苗，用自来水洗去附着的培养基，移栽到32孔育苗盘中。移栽基质为椰糠:泥炭土按体积比1:1。 7.3 苗期管理 保持基质内含水量50%～70%，温度25℃，遮荫度70%。待所有组培苗成活后，喷施2000倍叶面水溶复合肥（N:P2O5:K2O =15:5:25）。 8 种苗出圃 组培苗驯化移栽30 d～60 d左右可出圃。