蛋白定量检测

       基于质谱的蛋白质组定量检测方法包括使用稳定同位素标记的方法和无标记定量方法，其中稳定同位素标记方法的准确性更高，应用更广。根据稳定同位素掺入机制的不同，样品标记方法分为三类，即代谢标记法、化学标记法和酶解标记法。酶解标记法由于技术尚不成熟，其应用并不多。博奥晶典生物技术有限公司提供基于代谢标记（SILAC和Supper-SILAC方法）和化学标记（TMT和iTRAQ）的定量检测服务。临床组织样品的蛋白质组定量研究常使用化学标记法（TMT和iTRAQ）和Super-SILAC法。iTRAQ与TMT标记试剂的化学反应原理相似，iTRAQ标记试剂含有8个不同的标记标签，可以最多同时标记并混合8个样品进行定量检测；TMT标记试剂含有6或10个不同的标记标签，可以最多同时标记并混合6或10个样品进行定量检测。

实验原理
蛋白上的氨基酸残基标记上不同的同位素后，在质谱检测的时候，标记不同同位素的肽段就会发生m/z迁移，根据迁移峰的峰高或峰面积的比值获得不同标记多肽的相对量，从而达到蛋白相对定量的目的。代谢标记法使用稳定同位素标记的赖氨酸和精氨酸的培养基培养细胞（stableisotope labeling by amino acids in cellculture，SILAC），在细胞代谢过程中，新合成的蛋白将被标记上同位素。对于临床来源的样品，一种新的蛋白质组定量方法是使用稳定同位素标记的多种细胞提取物作为共同参照品进行定量检测。每一种待测样品通过与共同参照品进行比较后达到定量检测的目的。这种方法也称为Super-SILAC（NatMethods 7, 383-5 (2010)）。化学标记法使用小分子化合物（标签），通过化学反应连接到蛋白的活性基团，例如氨基或巯基，不同的样品连接上不同分子量的的标签，这些标签在二级质谱检测时被解离下来，形成独立的报告峰，根据报告峰的峰高或峰面积对不同样品的蛋白进行相对定量分析。常用的化学标记试剂包括TMT、iTRAQ等，它们可以标记多肽中的自由氨基，TMT或iTRAQ中不同标记标签标记后的多肽具有相同的分子量和疏水性，经HCD断裂产生的b、y离子用于定性鉴定，TMT或iTRAQ标签断裂生成的报告离子用于定量比较。TMT与iTRAQ分子结构相似，如下图（左）所示，TMT6不同标记标签如下图（右）所示：

实验流程