载体构建服务
目前市面上不同公司提供的表达载体骨架多达数百种,如何选择确实令人困惑。Cyagen 把大部分的真核表达载体骨架归纳为7个体系,能够满足客户的几乎所有需求。Cyagen 强大的元件库配合灵活的组合方式,可拼接出多达1600 种载体类型,囊括了市场上所有真核表达体系,能够在任何真核细胞中同时表达多达4 条的目的基因,可控地表达这些基因,可携带任何一种标记蛋白和抗药性基因,还可以可控沉默任何基因!
1、慢病毒载体(Lentiviral Vector)
2、腺病毒载体(Adenoviral Vector)
3、逆转录病毒载体(Retroviral Vector)
4、普通表达载体(Regular Expression Vector)
5、增强子功能研究载体(pHsp68 LacZ Vector)
6、PiggyBac 载体(PiggyBac Vector)
Cyagen 多基因表达系统
Cyagen 不仅提供单个基因表达载体构建服务,而且提供多基因表达载体构建服务。多基因表达的概念是指在一个启动子的驱动下两个(bicistronic )或者两个以上(multicistronic )的基因同时表达。多基因表达往往需要借助Linker 来帮助实现。Cyagen 的Linker 基因包括两种:Internal Ribosome Entry Site (IRES) 、2A 肽链(2A Peptide)
Cyagen 诱导型表达载体系统(inducible expression)
Cyagen 不仅提供组成型表达(constitutive expression )载体构建服务,而且提供诱导型(inducible expression) 表达载体构建服务。诱导型表达是指在诱导型启动子的驱动下,例如TRE,需要rtTA 这样的转录激活因子和doxycycline 药物的存在下,才能表达下游的基因。
病毒包装服务
Cyagen目前提供腺病毒、慢病毒与逆转录病毒表达系统,包括载体构建与病毒包装。您可以根据实验需要,选择合适的载体系统。
一、慢病毒系统
慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,因此它可以有效地感染包括神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等在内的几乎所有的哺乳动物细胞,并且感染效率非常高,是传统方法的数倍甚至数十倍。慢病毒可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达,是目前zei受欢迎的基因功能研究工具。慢病毒的研究发展很快,也很深入,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,预示着慢病毒有着广阔的应用前景。
Cyagen 慢病毒系统组成
1、一个表达载体,含有目的基因、目的基因的启动子以及其它病毒包装所需的必要元件;
2、一套包含三个辅助质粒的包装质粒Mix,分别表达产生病毒所需的结构蛋白和逆转录酶;
3、293FT 细胞株,能够在表达载体和包装质粒mix 共转染后包装出慢病毒。
系统优势
1、生产出以HIV-1 为基础的慢病毒,它能有效地转导分裂和非分裂的哺乳动物细胞,因此它的应用潜能超过传统的以MLV 为基础的逆转录系统。
2、无论靶细胞是在体内还是体外培养,慢病毒都能有效地将外源基因携带进去。相比传统腺病毒的瞬时转染,慢病毒能够将目的基因整合到宿主基因组,从而能够长期稳定地表达。
3、宿主非常广泛,包括人、猩猩、小鼠、大鼠、兔、狗等所有已经研究过的哺乳动物。
4、表达载体和包装质粒形成反式互补,且包装质粒又分别由三个质粒构成,, 从而为安全性提供了更加可靠的保障。
Cyagen 可选的载体元件列表
Cyagen 的载体元件库可以为您提供包罗万象的载体元件,包括大家熟悉的广泛表达启动子,也包括丰富的组织特异性表达启动子、各种颜色荧光标记基因、化学发光标记、色度法筛选基因、正负筛选基因、可诱导的rtTA 基因、双顺反子,标签蛋白等,均可根据您的要求进行选择。
二、腺病毒系统
采用Cyagen Adenoviral Expression System 生产出的腺病毒,它既能把外源基因携带进分裂细胞表达,又能把外源基因携带进非分裂细胞表达。
系统组成:
1、一个表达载体,含有目的基因、目的基因的启动子以及一些把这个载体包装进病毒的元件;
2、293A 细胞株,能够在表达载体转染后包装出腺病毒;
系统优势:
1、宿主范围广 -腺病毒可感染种类广泛的有丝分裂后期细胞;
2、包装容量大 -包装容量可以达到6 kb;
3、病毒滴度高 -病毒活性滴度达到1011 PFU/mL。
三、逆转录病毒载体系统
系统组成:
1、一个含有目的基因的表达载体;
2、一个编码VSV-G 的辅助质粒;
3、表达gag/pol 的辅助质粒;
4、293T 包装细胞。
系统优势:
1、转导效率高,能够有效提高基因的转染率;
2、相对于腺病毒来说,能够稳定整合到细胞的基因组中,能够稳定遗传。
四、shRNA 慢病毒技术服务
Cyagen 的 shRNA 慢病毒载体是由U6 启动子驱动shRNA 实现,并连接了eGFP,可以实时监测载体的转染效率,同时还包含Amp 抗性基因,可以无限制扩增。
shRNA 慢病毒系统作用示意图
设计shRNA 靶序列
一般情况下,Cyagen 将根据客户的目的 mRNA 靶基因,分别设计 3 条不同的shRNA 序列,shRNA 序列一般为 19 - 21bp 长。也可以按照客户的要求来设计,由客户确定shRNA 序列的长度。 对于每条选定的靶序列,设计正义链和反义链,以 loop(9nt ) 相连,合成shRNA(short hairpin RNA)。
shRNA 慢病毒载体构建
Cyagen 可为客户合成shRNA、双酶切shRNA 空载体、连接与转化、测序鉴定、载体制备及定量。
shRNA 慢病毒包装
Cyagen 可将构建好的shRNA 慢病毒载体包装成具有高转染效率的慢病毒,并提供病毒滴度检测服务。
实验结果
携带shRNA 的慢病毒载体、慢病毒及测序结果等。
优点
1、长时间抑制靶基因的表达,可持续数周;
2、相对其他RNAi 方法,成功率高,而且knockdown 更彻底;
3、在Tet-on 系统中可诱导抑制靶基因的表达;
4、用shRNA 慢病毒载体,大大提高了转导率。
shRNA 慢病毒干扰案例
五、Cyagen三套病毒系统比较