这是一个为电镜观察提供极薄（约为60nm）的样品切片的过程，它是整个制样程序的中心环节。大部分生物样品只有被切割成超薄切片的形式才能在电镜下进行观察。能否提供理想的超薄切片关系到能否进行电镜观察，以及能否有令人满意的观察效果。在此以前的环节都是为了能给切片提供一个合格、切割性好的样品，而最后的染色是为了增加超薄切片的反差以利观察，因此超薄切片是最重要的环节。超薄切片的好坏与切片机的性能、切片刀的质量、包埋块的切割性能及操作者技术经验等因素密切相关。
1.包埋块的修整：聚合好的包埋块需要除去组织周围多余的包埋介质，使组织露于包埋块的尖端，并将组织块顶面修成适当的形状和大小，再进行切片。 方法：将包埋块夹在专用夹持器上，用单面刀片首先在其顶端修切，暴露出样品，然后在包埋块四面修出与顶面成45度斜面的锥体形，顶端的切面可以大略修成梯形、矩形等形状，并做一记号（如去掉一角），以便于光学定位。
2.半薄切片：为了克服超薄切片的盲目性和电镜视野的局限性，提高电镜观察效果，在进行超薄切片前，需先进行半薄切片并染色，以便在光学显微镜下检查和较准确地选择超薄切片的部位进行光学定位。 2.1 切片制作方法：先在载玻片上涂一薄层牛血清，待其干燥后滴一滴双蒸水。在超薄切片机上使用玻璃干刀切1.5mm左右半薄切片，用镊子将切片转移到水面上，在70～80℃电热板烤干，切片即可贴紧于载玻片上。为防止在下面的染色过程中掉片子，每块样品可切3～5片半薄切片。 2.2 苏木素-伊红染色： ①在切片上滴2.5％过碘酸水溶液，置染色盘中，再放40℃恒温箱10～15分钟，自来水洗5分钟，过蒸馏水，烤干。 ②滴苏木素液于切片上，60℃染色20～30分钟，自来水洗5分钟，过蒸馏水，烤干。 ③1％伊红滴染15分钟，60℃，自来水洗5分钟，过蒸馏水，烤干。 ④中性树胶封盖。 在制作切片过程中注意要在电热板上烤干片子，而不能让其自然干涸，否则切片将贴不紧，易在染色过程中脱落。过碘酸氧化时，温度应控制在40℃不得超过，氧化的时间亦得严格控制，否则切片会折皱。染色盘中要保持一定的湿度，以防染液蒸干而污染切片或着色不匀。
3.定位修块：光镜下观察染好的半薄切片，选择要进一步观察其超微结构的组织细胞，并找出块上的相应位置，在显微镜下用双面刀片将周边其余的组织修去，留下进行超薄切片的组织面积不要大于0.5mm2。
4.超薄切片的制作： 4.1 清洗铜网：将曾使用过的铜网先用浓HCl浸泡5分钟，自来水洗数次，无水丙酮泡洗后，铺于滤纸上自然晾干，待用。清洗的目的是为了去除铜网上旧的支持膜、切片和其它污染物，以便支持膜与铜网得以牢固的贴附。 4.2 制备支持膜：铜网上需铺一层支持膜以承载面积很小的超薄切片，使之有所依附而得到稳固。支持膜的厚度约为10nm，太薄时易出现切片漂移或被电子束打破的现象，太厚时则会降低图象的分辨率。其方法是：先将干净载玻片浸入0.4％火棉胶醋酸异戊脂溶液中，提出载玻片并直立于滤纸上待干后即在载玻片上形成薄膜。用镊子尖沿玻片边缘划断膜的四边，将载玻片插入玻璃平皿的双蒸水中，使薄膜与载玻片剥离而漂浮于水面上；再将洗净的铜网凸面贴膜，排列于膜上，最后用干净载玻片捞起支持膜及铜网，烤干备用。 4.3 切片：用45度角玻璃刀，以6度间隙角在超薄切片机上切片，切片厚度为60～70nm，在显微镜下呈银白干涉光。用睫毛拨针将水槽液面上的切片聚拢起来，再用铂金环将其捞于环上，借助环上水的表面张力，使切片保持平整，而后贴到载网上，最后将载网置于滤纸上晾干，则切片就附于网上。 切片的厚度要适当，较薄的切片分辨率较高，但反差较弱；而较厚的切片反差虽好，但分辨率则较差。切片速度的控制也很重要，通常为2～5mm/秒，以避免速度过高时刀与样品块之间发生一种高频振动而导致切片出现颤痕。没有颤痕、皱褶、重叠、刀痕及空洞，厚度适中，薄厚均匀，结构清晰是理想超薄切片的衡量标准。由于样品的取材、脱水、浸透、包埋和切片诸个环节、各种因素都会影响到切片的质量，因此优质超薄切片的获得，离不开每个环节的规范操作。
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