PCR仪电源维修及技术原理
技术原理:
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
工作原理:
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时
过程:
1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,
氢键断裂,形成单链DNA
2.退火(复性)(25℃-65℃):系统温度降低,引物与
DNA模板结合,形成局部双链。
3.延伸(68℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活
性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延
伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度