保健品中16种氨基酸的液质联用法测定

　　氨基酸是氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。无色晶体，熔点极高，一般在200℃以上。不同的氨基酸其味不同，有的无味，有的味甜，有的味苦。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶于有机溶剂。 
　　近年来，随着技术的发展，检测氨基酸的种类及含量的方法很多，目前测定氨基酸的方法主要有氨基酸分析仪法[1]、高效液相色谱法[2]、毛细管电泳法[3]及液相色谱-质谱联用法[4]等。本文主要是通过高效液相串联质谱法来对16种氨基酸的含量进行测定，方法简单，快速，不用柱前衍生，节省试剂和成本，为保健品中氨基酸的含量测定提供了新方法。 
　　1 实验部分 
　　1.1 仪器和试剂 
　　16种氨基酸的混合标准品，（包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丝氨酸）安捷伦；乙腈（色谱纯）CNW；乙酸铵（色谱纯）；乙酸（色谱纯）。 
　　超声波清洗器（EQ-500）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海鸿都电子科技有限公司）；BPZ-6090Lc型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；高效液相色谱仪（安捷伦1260）；色谱柱：安捷伦poroshell 120 EC-C18柱（4.6mm×50mm，2.7μm）；质谱（API3200）美国AB公司。 
　　1.2 色谱条件 
　　流动相：称取0.35g乙酸铵加水0.5L溶解，然后加入0.5L乙腈，混合，用乙酸调pH=3.5，过滤，即得。流速：0.25mL/min；柱温：40°C；时间：5 min ；进样量：5μL 。 
　　1.3质谱条件 
　　1.3.1以电喷雾电离源（ESI）阳离子模式，气帘气20psi，碰撞气6，喷雾电压5500V，离子源温度600°C，雾化气是50 psi，辅助气是50 psi，时间5min。 
　　1.3.2 16种氨基酸的质谱参数，见表1。 
　　1.4 标准品溶液的配制 
　　量取16种氨基酸的混合标准品1ml，置于50ml容量瓶，加0.1%甲酸水定容，摇匀即得标准品贮备液。 
　　1.5 供试品溶液的制备 
　　精密称取样品约0.1g，置于25ml磨口的具塞比色管内，加6mol/L盐酸15ml，加入0.2g苯酚，用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散并溶解，充氮气，盖紧塞子，置于110℃±1℃的恒温干燥箱内，水解22小时，取出冷却，过滤，用纯化水冲洗比色管，将水解液全部转移至50mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度，摇匀，精密吸取1mL于10mL容量瓶中，置于真空干燥箱内，于40℃～50℃减压干燥（真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂），干燥后残留物用0.1%甲酸水定容至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，即得。 
　　1.6 线性实验 
　　将标准品贮备液稀释成0.004nmol/μl，0.008nmol/μl，0.012nmol/μl，0.016nmol/μl，0.020nmol/μl浓度梯度，每个浓度以5μL注入色谱系统。 
　　1.7 精密度实验 
　　将标准品贮备液稀释至一定的浓度，按色谱、质谱条件进行测定，连续进样6次。 
　　1.8 加样回收率实验 
　　精密称取五分的供试品，每份加入0.020nmol/μl标准品溶液5ml，定容。以5μL注入色谱系统。 
　　1.9供试品的测定 
　　把1.5制备好的供试品溶液，以5μL注入色谱系统。以标准液的峰面积和浓度，通过外标法做曲线算出样品的浓度。 
　　2 结果与讨论 
　　2.1 色谱行为 
　　由于保健品中的氨基酸，用高效液相荧光法要进行柱前衍生，成本很高而采用液质联用法，不需要衍生，可大大节约成本，用流动相（0.35g乙酸铵加水0.5L溶解，然后加入0.5L乙腈，混合，用乙酸调pH=3.5）时，5min就能把16种氨基酸全部流出。采用液质联用法，通过MRM模式进行母离子及相应的子离子进行检测，能达到准确的分离和定量，见图1 
　　从左到右，分别为丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丝氨酸。 
　　2.2 质谱行为 
　　在ESI（+）阳离子检测方式下，16种氨基酸的质谱定量分析，在质谱条件下，失去NH3形成[R-CH-COOH]+ 峰，或失去HCOOH重排生成[R-CH=NH2]+ 峰，从而进行色谱分离。 
　　2.3 线性回归方程和最低检测限 
　　以标准品的5个梯度浓度与其峰面积进行线性回归，拟合线性回归方程为Y=aX + b，相关系数r2 及最低检测限（S/N（信噪比）=3时，可测得标准品的最低检测限）见表2。 
　　3 结论 
　　本文采用（0.35g乙酸铵加水0.5L溶解，然后加入0.5L乙腈，混合，用乙酸调pH=3.5）作流动相，经安捷伦EC-C18（4.6mm×50mm，2.7μm）色谱柱，使用液质联用法，能很快把16种氨基酸分离，进行检测。通过测定回收率，精密度，线性关系，表明该方法用于测定保健品中16种氨基酸的含量，结果令人满意。