抗痨清肺颗粒HPLC特征图谱及液质联用分析

抗痨清肺颗粒HPLC特征图谱及液质联用分析

　　抗痨清肺颗粒由百部、橘络、矮地茶、黄精、玉竹等7味药组成，源于长沙市中心医院的临床经验方，主要用于多耐药性肺结核的治疗。该制剂成分复杂，其中玉竹、黄精等含有较多皂苷及多糖类成分[1-2]，橘络、矮地茶等含有较多黄酮类、香豆素类等成分[3-4]，百部的主要活性成分为生物碱类、糖类等[5]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对该制剂的特征图谱进 
　　基金项目：国家科技重大专项-重大新药创制（2013ZX10005004- 003-001） 
　　通讯作者：夏新华，E-mail：xiaxinhua001@163.com 
　　行研究，为抗痨清肺颗粒的质量控制提供依据。 
　　1 仪器与试药 
　　岛津高效液相色谱仪（N3000色谱工作站，SPD- 10Avp检测器，LC-10ATvp泵）；质谱仪（Agilent6530），配有Agilent1200液相色谱仪；SB-5200D超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，功率300 W，频率50 Hz），XB-220A型电子分析天平（瑞士PRECISA）等。 
　　抗痨清肺颗粒10批，实验室自制；橙皮苷（批号110721-201115），中国食品药品检定研究院；药材饮片，购自湖南三湘中药饮片有限公司；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。 
　　2 方法与结果 　　2.1 色谱条件 
　　采用Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-1%醋酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（见表1），流速1.0 mL/min，检测波长290 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL，记录时间120 min。 
　　2.2 质谱条件 
　　离子源为ESI源，一级全扫描，正负离子分别采集数据，雾化器压力40 psi，毛细管电压4 kV，干燥气流量6 L/min，干燥气温度325 ℃，离子源温度350 ℃。 
　　2.3 对照品溶液的制备 
　　精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.28 mg/mL的溶液，即得。 
　　2.4 供试品溶液的制备 
　　取本品4.0 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，水浴回流45 min，冷却，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。 
　　2.5 各药材溶液的制备 
　　精密称取矮地茶、橘络、黄精、玉竹等药材粗粉适量，分别按“2.4”项下方法制备，即得。 
　　2.6 方法学考察 
　　2.6.1 精密度试验 取供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.1%～1.4%，相对保留峰面积RSD为0.2%～3.0%，表明仪器精密度良好。 
　　2.6.2 重复性试验 取同一批样品4.0 g，共6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，分别进样，结果测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.1%～0.7%，相对保留峰面积RSD为1.3%～3.0%，表明该法重复性良好。 
　　2.6.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24 h进样，结果测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.1%～1.0%，相对保留峰面积RSD为0.1%～2.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定。 
　　2.7 特征图谱建立及评价分析 
　　2.7.1 特征图谱的构建与相似度评价 取样品10批，分别按“2.4”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录120 min的色谱图。根据各样品色谱图所给出的峰数、峰面积积分值及相对保留时间，选取其中13个共有峰作为特征峰（见图1）。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》对10批样品的HPLC色谱图进行相似度评价，即任选一样品色谱图作为参照图谱，进行多点校正，自动匹配（时间窗宽度为0.10），用中位数法生成对照图谱（共有模式图），计算相似度。结果10批样品色谱图具有较高的相似度（>0.995），表明该制剂制备工艺稳定。 
　　2.7.2 共有特征峰的标定 选择橙皮苷峰（10号峰，保留时间为70.67 min±0.12 min）为参照峰（S峰），将各共有峰的保留时间与S峰的保留时间进行比较，计算相对保留时间。10批抗痨清肺颗粒共有特征峰的平均相对保留时间分别为1号峰0.09、2号峰0.10、3号峰0.13、4号峰0.23、5号峰0.29、6号峰0.31、7号峰0.50、8号峰0.53、9号峰0.94、10号峰1.00、11号峰1.16、12号峰1.25、13号峰1.33。 
　　2.7.3 共有特征峰峰面积比 以橙皮苷峰（S峰）峰面积为1，计算各共有特征峰的峰面积与S峰峰面积的比值（相对峰面积）。结果10批抗痨清肺颗粒共有特征峰的平均相对峰面积分别为1号峰0.06、2号峰1.27、3号峰0.98、4号峰0.07、5号峰0.30、6号峰0.11、7号峰0.05、8号峰0.11、9号峰0.28、10号峰1.00、11号峰0.09、12号峰0.01、13号峰0.01。其中，2、3号峰与10号峰峰面积均占总峰面积的20%以上。 
　　2.7.4 共有特征峰的辨识与归属 取橙皮苷对照品溶液及矮地茶、橘络、玉竹、黄精、百部等药材溶液，按上述色谱条件进行测定。将各对照品、药材图谱与供试品特征图谱进行比较（见图2），通过考察各色谱峰的相对保留时间、峰形等，对供试品特征图谱的共有峰进行辨识与归属。结果表明，1、3、5～7、9～12号峰的专属性较强，其中1、5号峰为矮地茶的特征峰，3号峰为黄精的特征峰，6、7号峰为百部的特征峰，13号峰为玉竹的特征峰，9～12号峰为橘络的特征峰群，可用于该制剂中上述药材的定性鉴别；2、4、8号峰未找到归属，可能为该制剂在制备过程形成的新组分。 
　　2.7.5 共有特征峰成分分析 按照上述色谱和质谱条件，对供试品溶液进行HPLC-MS/MS分析。根据各色谱峰在正离子模式或负离子模式下获得的一级质谱中的准分子离子（[M+1]+、[M+Na]+、[M-1]-）及其二级质谱的碎片离子所提供的信息，结合相关文献[6-13]对特征图谱中8个共有特征峰所表征的成分进行推测，结果见表2。 
　　3 讨论 
　　本试验考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-1%醋酸不同流动相系统对特征图谱的影响，结果以乙腈-1%醋酸流动相系统分离度好，基线平稳。分别在205、230、254、275、296、290、312 nm对供试品溶液进行检测，结果显示，在290 nm处，基线平稳，峰形良好，峰数较多，故选择290 nm作为检测波长。 
　　本试验还分别考察了不同提取溶媒（无水乙醇、甲醇、80%甲醇、60%甲醇、80%乙醇）对样品特征图谱的影响，结果表明，以甲醇作为提取溶媒时，峰形和峰数均能得到满意的效果。同时，分别考察了不同提取方法（超声、水浴回流）对特征图谱的影响，结果显示，水浴回流提取更能充分溶出抗痨清肺颗粒中的有效成分，故采用回流提取45 min作为供试品溶液的制备方法。 
　　在各批样品的指纹图谱中，橙皮苷保留时间居中，峰面积占总峰面积的22.43%，故确定橙皮苷（10号峰）为参比峰（S峰），用于相对保留时间和相对保留峰面积的计算。该特征图谱共有峰有13个，其中黄精、玉竹、矮地茶、橘络都能与相应峰进行定位，但还有3个峰未能进行归属，其中2号峰吸收较强，可能为制剂在制备中形成的新组分。另外，该制剂中还有2味药也未能找到归属（图2中的药材A、药材B），可能与其在上述色谱条件下无明显色谱峰有关。