鸭源性核酸PCR-荧光探针试剂盒植物叶蛋白的提取主要有盐析法、有机溶剂沉淀法、加热法(含逐步和快速加热)、 离心分离法、结晶和重结晶法等。依据今后的开发方向(以饲料为基础，以食品、饮品为开发方向)及简便易行和使用的原则，主要采用盐析法、加热法和有机溶剂法分离提取叶蛋白(冷提和热提)。不同的提取方法，对样品的处理方式、程度和要求不同，结果也有差异。
(一)改良丙酮沉淀法提取叶蛋白
取0.3g 左右的植物叶片，用液氮研磨，色素多的可按材料鲜重的10%加入PVP，并将充分研磨过的样品转入离心管中，加入4mL 的提取缓冲液，摇匀并放在4℃条件下提取1h，充分溶解蛋白。放置后的样品充分摇匀，4℃10000r/min 离心30min，弃沉淀，上清液中加入2.5～3倍体积的村-20℃条件下，让蛋白充分沉淀。之后，4℃10000r/min 离心30min，其上清，沉淀置于-20℃下，使丙酮完全挥发，如有必要加入上样缓冲液溶解沉淀。缓冲液用量300ul，沉淀充分溶解后，转移至1.5mL 离心管中，4℃12000r/min 离心15min ，取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。
鸭源性核酸PCR-荧光探针试剂盒该方法提取的蛋白质，提取效率高，杂质干扰少，电泳结果蛋白条带清晰，数量多。
(二)植物叶片总蛋白的提取—三氯醋酸—丙酮沉淀法
①在液氮中研磨适量的叶片;
②悬浮于含10%的三氯醋酸和含0.07%β-巯基乙醇(可用DTT 代替)的丙酮溶液在-20℃条件下冰浴;
③让蛋白质沉淀后离心(4℃ 10000r/min 离心30~60min)，弃上清;
④重悬沉淀浮于含0.07%β-巯基乙醇的预冷丙酮溶液中;
⑤离心(同上)后真空干燥沉淀;
⑥用上样缓冲液溶解沉淀，离心;
⑦Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管中保存在-78℃备用。
(三)鸭源性核酸PCR-荧光探针试剂盒分步提取可溶性叶蛋白
(1)蛋白质浸出 ①水溶性蛋白质浸出：用0.05molpH7.0的磷酸缓冲液(或蒸馏水)将样品制成匀浆液，然后离心15min(4000r/min)，收集上清液即蛋白质浸出液，再将沉淀物按上述操作重复两次。②盐溶性蛋白质浸出用10%NaCl 将前者剩余沉淀物分离提取两次，收集蛋白质浸出液。
(2)蛋白质沉淀用0.1mol 醋酸将蛋白质浸出液pH 值调至蛋白质等电点(pH4.5左右)，即8体积蛋白质浸出液加入1体积0.1mol 醋酸，混匀，离心15min(3000r/min)，弃去上清液，沉淀物即为可溶性叶蛋白。
(3)蛋白质收集于沉淀物中加入95%乙醇，混匀，用定量滤纸过滤或抽滤，待风干后收集。
(四)沉淀法提取叶蛋白
取0.3g 植物叶蛋白，用液氮充分研磨转入离心管中，加入3mL 提取缓冲液，摇匀并放在4℃条件下提取1h，充分溶解蛋白后，4℃10000r/min 离心20min，弃沉淀，上清液中加入(NH4)2SO4 ，混匀1h，按1：2(v/v)加入-20℃预冷的80%丙酮，混匀后4℃12000r/min 离心10min，沉淀在-20℃冰箱中放置20min，使丙酮完全挥发后加适量上样缓冲液，待沉淀充分溶解后，4℃12000r/min 离心5min，取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。
首页
