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分子杂交的原理分析

2019.3.03
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zhaochenxu

致力于为分析测试行业奉献终身

BILON品牌的FYY系列分子杂交仪号:200520070121X。该仪器采用微电脑智能控制,液晶显示三种功能:温度显示、瓶架旋转速度、托盘摆动速度。具有存储记忆功能,可以直观显示系统的运行状况。温度控制采用数字PID技术,输出采用PWM方式,控温精度高,稳定性好,并设有超温保护装置。该仪器可以同时直观箱内控温温度,滚动式瓶架旋转速度,酶标板或试剂 托盘的摆动速度。同时任意选择您所需要的控温温度,瓶架旋转速度,摇床摆动速度。

分子杂交基本原理:

分子杂交指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA或RNA),在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理,形成异质双链的过程。通过此原理,就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针,去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 

复性:变性DNA只要消除变性条件,二条互补链还可以重新结合,恢复原来的双螺旋结构,整个过程称为复性。 

退火:通常DNA热变性后,将温度缓慢冷却,并维持在比Tm低25~30℃左右时,变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构,这一过程又叫做退火。 

复性后的DNA,理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却,则不能复性。 

影响复性速度的因素: 

1、DNA的浓度愈高,复性速度也愈快。 

2、DNA片段的大小:DNA片段愈大,扩散速度愈低,使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此,在复性实验中,必要时将DNA切成小片段,再进行复性。 

3、温度过高不利于复性。 

4、溶液的离子强度:通常盐浓度较高时,复性速度较快。 

5、DNA顺序的复杂性;简单的分子复性很快,如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互补识别很快,故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究,可以了解DNA顺序的复杂性。

DNA变性:DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成单链无规则线团,因而发生性质改变(如粘度下降,沉降速度增加,浮力上升,紫外吸收增加等) 。 

1.DNA变性的方法:加热;改变DNA溶液的pH;有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素。 

2、增色效应:DNA在260nm处有zui大吸收值,由于含有碱基的缘故。在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧,变性时由于双螺旋解开,于是碱基外露,260nm紫外吸收值因而增加,该现象称为增色效应。利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。 

3、溶解曲线:升高温度使DNA变性,以温度对紫外吸收作图,可得到一条曲线,称为溶解曲线。 

4、融解温度:通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度(熔解曲线中点对应的温度),由于这一现象和结晶的融解相类似,故又称融点或融解温度。因此Tm是指消光值上升到zui大消光值一半时的温度。 

5、影响Tm值的因素:Tm不是一个固定的数值,它与很多因素有关: pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升,Tm值也随着增大。 DNA的碱基比例、DNA的均一性 ;在相同条件下,DNA内G-C配对含量高,其Tm值也高。 

6、DNA中的GC含量与Tm值关系: 

Tm = 69。3+0。41 × % (G+C) 

对于小于20bp的寡核苷酸,Tm=4(G+C)+2(A+T) 

实验表明DNA分子中(G+C)克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系。 


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