RNA在脊椎动物胚胎和器官中整体标本原位杂交检测实验1

转录的时空分布（如胚胎发生过程中）情况可以为研究编码基因产物的功能及与其他基因之间可能的相互作用提供重要的线索。来源：《精编分子生物学实验指南》第五版

小鼠或者鸡的胚胎以及器官中的整体原位杂交

• 实验方法原理
  实验材料	小鼠或鸡的胚胎或器官
  试剂、试剂盒	PBS 冰预冷PBT： PBS 中加 0.1% (V V) Tween 20 4℃及室温4% （m V)高聚甲醛溶于 PBS (4% PFA) 4℃PBT中溶25%、50%、75%的甲醇（甲醇 PBT)100%甲醇PBT中溶6% (V V)过氧化氢（H2O2; Aldrich)(可选）
  仪器、耗材	解剖工具（如剪刀和镊子）70%乙醇浸泡解剖显微镜20 ml咬合盖（snap-cap)玻璃小瓶小勺或者刮铲用来放置2 ml小离心管的带有适配器的加热板旋转平台（Rocker platform)
  实验步骤	1) 如果有必要的话，在冰冷的PBS溶液中，使用合适的解剖器具在解剖镜下将小鼠或鸡的胚胎切成小块。完全除去胚胎外膜和胞衣。打开腔。 2) 将样本转移到装有10 ml左右冷的4%多聚甲醛的20 ml咬合盖玻璃小瓶中。4℃固 定4 h到过夜。 3) 4℃下用PBT洗样本两次。即使样本不做存储立即使用，也建议进行脱水、水化和漂白步骤（步骤4〜8)，这些步骤可以改进组织的浸透性并且增加方法的灵敏度。也可以选择胚胎直接从步骤8开始操作。 4) 室温下分别用25%、50%和75%的甲醇/PBT洗样本，最后用100%甲醇再洗2次 以达到脱水的目的。 5) 室温下使用甲醇/PBT溶液以相反的步骤洗样本，最后再用PBT洗2次以水化样本。 6) 可选步骤：用含有6%双氧水的PBT溶液室温下漂白样本15 min。 7) PBT溶液洗样本3次。 8) 用溶于PBT中10μg/ml的蛋白酶K室温下消化样本15 min。 9) 用新鲜配置溶于PBT中的2 mg/ml甘氨酸洗样本以终止消化。 10) PBT洗样本2次。 11) 新鲜配制的0.2%戊二醛/4%多聚甲醛/PBT再在室温下固定样本20 min。 12) PBT 洗 3 次。 13) 向玻璃小瓶中加1 ml预热的预杂交溶液A，然后转移样本到2 ml离心管中。 14) 移除溶液然后加2 ml新鲜配置并预热的预杂交溶液A。盖上盖子，放在65℃加热 板上并确保盖子不暴开。将加热器的侧面连在旋转平台上。65℃预杂交样本3h。 不管是在步骤14以前还是以后，样本都可以在预杂交溶液中-20℃保存6个月。 15) 移除预杂交溶液，加入1 ml含有1μg /ml地高辛标记核酸探针的杂交溶液A，70℃杂交过夜 对于3个10. 5天的小鼠胚胎、2个11. 5天小鼠胚胎或者5个17期的鸡胚胎来说，1 ml的杂交溶液就足够了。 16) 接下来用酶探测RNA杂交物 收起
  注意事项
  其他	其他试剂： PBT中溶10μg/ml蛋白酶K，没有预先消化的 PBT中溶2 mg/ml甘氨酸（Merck) 新鲜配置，PBT中溶4% (m/V)高聚甲醛和0.2% (V/V)戊二醛（EM级，Sigma) 新鲜配制预杂交溶液A，杂交溶液A:在预杂交溶液A中加入终浓度1μg/ml的地高辛标记的核酸探针

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