RNA在脊椎动物胚胎和器官中整体标本原位杂交检测实验2

预杂交溶液A 70℃2×SSCpH 4.570℃ 0.1% (V V) CHAPS3- [ (3-胆胺丙基）二甲铵]-I-丙烷磺酸盐） (3- [ (3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate) 2×SSC70℃

塑料的巴斯德吸管可放置2 ml微量离心管的70℃加热块旋转平台37℃和70℃水浴锅20 ml的咬合盖玻璃小瓶锡箔带照相机的解剖显微镜

1)从杂交过的小鼠胚或鸡胚或器官样本移除杂交溶液并加入800μL预杂交溶液A， 7℃洗 5 min。

2)不要移除预杂交溶液，向试管中再加入400μL 2×SSC, pH 4.5溶液，70℃洗 5 min,重复加2×SSC2次，并再洗2次。

3)移去混合液，并在0.1% CHAPS/2×SSC中70℃洗两次，每次洗30 min。

4)用含有20μg/ml RNA 酶 A 的 0.1% (V/V) CHAPS/2×SSC 溶液 37℃消化1 h。

5)先用MAB室温下洗样本两次，每次10 min,再在70℃用MAB洗2次，每次 30 min。

6)PBS室温下洗样本两次，每次10 min。

7)PBT室温下洗5 min。

8)室温下用封闭液封闭样本2〜3h。

9)移去封闭液，加入2 ml预吸附处理的连接碱性磷酸酶的抗地高辛抗体Fab片段。4℃下轻摇过夜。

10)移除溶液并加入0.1%(m/V) BSA/PBT溶液，将样本转移到20 ml的带咬合盖玻璃 小瓶中，用0.1% (m/V) BSA/PBT溶液室温下洗5次，每次45 min并轻轻摇晃。

11)用PBT溶液洗2次，每次30 min。

12)NTMT缓冲液洗3次，每次10 min。

如果使用Boehringer Mannheim公司的BM紫AP底物溶液则只需洗2次。

13)将样本完全浸没于3 ml NBT/BCIP显色溶液或者BM紫AP底物溶液中孵育。用锡 箔包住小瓶轻轻摇晃20 min开始显色。

14)用肉眼或者用解剖镜观察染色情况。当信号达到希望的水平时（20 min〜48 h), 用PBT至少洗6次以停止显色反应。

显色的样本能够在4℃下含有100 mmol/L EDTA的PBT中保存2〜3个月而不影响信号强度。

15)可选：在4%PFA/PBT中4℃固定样本过夜。用PBT洗样本数次然后在PBT中 4℃存储。

16)样本放在PBT溶液中在皮氏培养皿拍照。

其他试剂：

20μg/ml RNase A (Boehringer Mannheim)溶于 0.1% CHAPS/2×SSC, 70℃。

马来酸缓冲液（MAB) 70℃和室温 ，PBS，PBT ：0.1% Tween-20/PBS，封闭液

连接碱性碟酸酶的抗地高辛抗体的Fab片段（Boehringer Mannheim),预吸附的 40℃，0.1% (m/V) BSA/PBT，碱性磷酸酶缓冲液 pH 9.5 (NTMT),新鲜配制

2 mmol/L左旋咪唑/NTMT (可选的），NBT/BCIP 底物溶液或者 BM 紫 AP 底物