蛋白质氨基端及羧基端序列分析实验6

乙酸酐 二甲基吡啶烷基化乙内硫酰脲 (ATH) 氨基酸标准品溴甲基萘的乙腈溶液考马斯亮蓝（R250）二异丙基乙胺（DIEA)的庚烷溶液乙酸乙酯甲醇N-甲基咪唑的乙腈溶液异氰酸苯酯的乙腈溶液哌嗪硫氰酸酯的乙腈溶液四丁基铵硫氰酸酯的乙腈溶液三氟乙酸（TFA)

氨基端测序仪氩气烧杯羧基端测序仪加热块微型离心管培养皿PVDF 膜反应容器反相C18柱

一、将蛋白质转移到 PVDF 膜上

步骤1 利用电印迹法或从溶液中直接吸收（利用 ProSorb 样品制备容器），向 PVDF 膜转移 50?IOOpmol 的蛋白质样品。具体如下。

对于蛋白质电印迹到 PVDF 膜：

1.将凝胶中分离的蛋白质电转移到一张 PVDF 膜上（见方案 2 和 Mozdzanowski,et al,1992)。

2.用考马斯亮蓝 R250(见方案 3) 浸染含有目的蛋白的 PVDF 膜。将膜在空气中晾干。

实验提示：可以用两张纸夹住膜，挂在化学容器中或直接在工作台上干燥，不过要在膜上盖一张滤纸以防止污染。

3.切下目的蛋白条带或点

如果不是立即进行分析，条带/点可以在 -20°C 下保存几个月。

4.如果需要同时进行氨基端序列分析和羧基端序列分析，那么进行步骤2，对固定在 PVDF 膜上的样品进行氨基端测序；如果只需做羧基端测序，那么将结合在膜上的蛋白点放入 1.5 ml 微量离心管，进行步骤3。

对于将溶液中的蛋白吸附到 PVDF 膜（ProSorb):

1.用 5ul 的甲醇润湿 PVDF 膜。

2.向样品贮存器中加入 100ul 0.5% 的 TFA。

3.向样品贮存器中加入 5~800ul 蛋白质样品缓冲液。

4.如果样品缓冲液中含有盐分或其他低分子量杂质，用 100ul 0.1% 的 TFA 洗膜，洗 2 遍以上。

5.将内有 PVDF 膜的样品贮存器嵌入到一个培养皿中，确保结合蛋白质的膜面朝上。

6.用一个玻璃烧杯罩住嵌入的膜（在贮存器中），将培养皿置于设为 60°C 的加热块上。完全干燥 PVDF 膜（约 20 min)。

目的是在 PVFD 膜干燥的过程中避免接触空气中的污染物，也避免烧杯接触到膜。

7.小心地取出 PVDF 膜。

8.如果需要同时进行氨基端序列分析和羧基端序列分析，那么进行步骤②，对固定在 PVDF 膜上的样品进行氨基端测序；如果只需做羧基端测序，那么将结合在膜上的蛋白点放入 1.5 ml 微量离心管，进行步骤③。

二、氨基酸测序

步骤2 依次进行氨基端和羧基端测序：

1.以 5~25 个循环进行氨基端序列分析。

2.将膜放入 1.5 ml 微量离心管，进行步骤③。

步骤3 准备羧基端测序的样品:

1.向 PVDF 胰加人『1: 溶于庚 5%DIEA, 使庚練在 6(TC 蒸发约 Imin0

2.加人 5ul 溶于乙腈的 1% PIC，60℃ 温育 5 min。

3.将带有 PIC-衍生样品的 PVDF 膜转移到羧基端测序仪器中的反应器内。