实验方法原理
蛋白质的α-氨基与丹磺酰氯(DNS-Cl 是一种荧光物质) 反应, 生成DNS-蛋白质, 经水解可生成DNS-氨基酸。通过聚酰胺薄膜层析分析DNS-氨基酸, 可确定蛋白质的N-末端氨基酸。此法灵敏度高, 也可用于蛋白质的氨基酸组成的测定。聚酰胺对极性物质的吸附作用是: 它能和被吸附物质间形成氢键, 这种氢键的强弱决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离物在聚酰胺表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程, 就能导致分离物达到分离的目的。
实验材料 蛋白质
试剂、试剂盒 氨基酸丙酮丹磺酰氯盐酸碳酸氢钠甲酸水苯冰醋酸乙酸乙酯甲醇冰乙酸磷酸三钠乙醇三乙胺
仪器、耗材 真空干燥器水解管烘箱紫外分析灯玻璃试管聚酰胺薄膜
实验步骤
1. 标准氨基酸的丹磺酰化
分别称取2 . 3μmol 层析纯的氨基酸, 溶于0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L碳酸氢钠溶液中。取0 . 1 ml 于有塞玻璃试管中, 加入0.1 ml DNS-Cl 丙酮溶液, 检查pH, 必要时用三乙胺调pH9 . 0～ 9 . 5 ,于室温(25 ℃ 左右) 下放置2～ 4 h。再用无离子水稀释10 倍,贮存于暗处。经层析, 得DNS-氨基酸的标准图谱。
2. 蛋白质N-末端氨基酸的DNS 化
取0 . 5 mg 蛋白质样品, 置于有塞玻璃管中。用少量水溶解后, 加入0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L 碳酸氢钠溶液。再加入0 .5 mlDNS-Cl丙酮溶液, 用三乙胺调至pH9 . 0～9 . 5 , 塞好塞子, 于40 ℃ 烘箱中反应2 h , 或室温(25 ℃左右)放置2～4 h , 生成DNS-蛋白质。
3. DNS-蛋白质的水解
DNS 化反应结束后, 真空蒸去丙酮, 加入0 . 5 ml 6 mol/ L 盐酸溶解DNS-蛋白质。全部移入水解管, 抽真空封管, 于111 ℃烘箱中水解18～24 h。开管后蒸去盐酸, 加少量水, 再蒸干。重复2～3 次以除尽盐酸。
4. DNS-氨基酸的抽提
将上述水解产物, 加0 . 5 ml 水, 用1 mol/ L 盐酸调至pH2～3。加入0 . 5 ml 乙酸乙酯抽提, 分层可在细长滴管中进行。重复抽提2～3 次, 将上层抽提液合并于小试管中, 抽去乙酸乙酯,置于干燥器中备用。
5. DNS-氨基酸的层析与检测
生成的DNS-氨基酸和标准DNS-氨基酸分别进行聚酰胺薄膜层析。
（1）聚酰胺薄膜的准备
将聚酰胺薄膜剪成7 cm×7 cm 的方块, 在距边0 . 5 cm 处画互为垂直的两条基线, 交叉点为原点。若只做单相层析, 则只画一条基线, 在基线上每隔1 cm 画一点样点。
（2）点样
用毛细管取样, 点在点样位置上, 点样直径应小于2 mm。若多次点样, 则点一次, 吹干一次。
（3）展开
将点好样的聚酰胺薄膜卷成圆筒形, 样品则在筒内, 箍以线圈固定。放在小层析槽内(可在小干燥器内置一培养皿代替) ,槽内( 培养皿) 放入5～10 ml 展开溶剂Ⅰ , 进行展开, 以溶剂前沿到达距顶端0 . 5 cm 左右为止( 约20 min )。取出膜片, 吹干。进行双向层析时, 在第一向层析完毕, 完全吹干(有时需晾过夜, 才能充分吹干) , 将聚酰胺薄膜片转90°, 用展开溶剂Ⅱ 展开。为了区分DNS-苏氨酸或者区分DNS-天门冬氨酸与DNS-谷氨酸, 可在溶剂Ⅱ展开后, 吹干, 接着用溶剂Ⅲ沿同一个方向展开, 只需展开至一半高度即可。为了区别ε-DNS-赖氨酸、α-DNS-组氨酸与DNS-精氨酸, 应在溶剂Ⅱ 中展开后, 吹干, 接着在溶剂Ⅳ中沿同一个方向展开。
（4）DNS-氨基酸的检测
展开结束后, 取出薄膜, 用电吹风机吹干, 在360 nm 或280 nm的紫外灯下检测。DNS-氨基酸呈黄色荧光。此外还有其他颜色的杂点, 如DNS-OH 显绿色荧光等。用样品的层析谱与标准DNS-氨基酸层析谱相比较, 可鉴别样品DNS-氨基酸的种类。
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