氮舱减压法裂解培养细胞实验

动物细胞或组织

匀浆溶液PBS

细胞破碎舱细胞刮刀

1确保出口关闭（但不要过紧），并把装置放入冰中预冷（如果有必要）

②准备要破碎的细胞或组织。

贴壁培养的细胞：用磷酸盐缓冲液（PBS)温和地洗细胞2〜3次，用橡胶细胞刮刀，把细胞从培养器皿中刮到PBS溶液中。非贴壁培养的细胞：400g离心10min，收集细胞，用PBS洗细胞2〜3次。动物组织：用机械匀浆器，纱网或过滤筛过滤，将组织绞碎。

③4C条件下480g离心5min收集细胞。

④去掉上清液，用10倍体积（约15ml)的匀浆溶液重悬细胞，然后转移上清至一个塑料烧杯（含有磁力搅拌棒）中，温和地搅动、混匀，以获得均一的悬浮液。

⑤从冷却的细胞破碎舱中旋转、托出过滤支架。

⑥在细胞破碎舱中加入15ml的细胞悬浮液。若体积较大，可以用较大型号的破碎舱，也可以使用其他的氮气压力舱。

⑦复位过滤支架。

⑧通过拧紧压力舱顶部的螺丝，使之与无氧氮源连接起来，该螺丝应该已经连接在氮源上，只需一个扳手即可。

⑨最好在低温下更换压力舱。

⑩让氮气从汽缸流人破碎舱，加压到预期值。必须有压力计显TK压力舱内的压力。所需的压力取决于要破坏的细胞的类型。一般使用的压力为：

a.KB(人类口腔上皮癌细胞）细胞500psi(相当于3.45MPa)

b.大鼠肝细胞500psi(相当于3.45MPa)

c.鸡红细胞1000psi(相当于6.9MPa)

每一次实验，步骤⑩必须选择最合适的预期值。一般，低压能更大程度地获得完整的细胞器，而高压则使匀浆更为彻底。难以裂解的细胞则需要多次处理，以获得更彻底的匀浆。破碎不同细胞所需的有效压力在表3.6中示出。

注意：没有经验的工作者处理高压气体时必须在使用汽缸前寻求专家的帮助。

⑪将加压装置至少平衡30min，以便使氮气溶解并在细胞内达到平衡。在这期间用磁力搅拌器温和地搅动1〜2次，或间断地温和晃动，以确保细胞处在均一的悬浮液中。

⑫把收集容器（如烧杯）放在出口旁，并冰浴。

⑬维持压力装置的工作状态（保持压力），缓慢打开出口，直到细胞悬浮液开始流人已经冷却的收集容器，在所有的悬浮液流尽之前要维持压力。合理的流速是每秒3〜10滴。当幵始流出泡沫，表明装置内的液体几乎流完，同时会伴有微弱嘶嘶声。随着压力的释放，细胞就会破裂，但是通过出口的微孔也会帮助细胞裂解。

注意：匀浆液由高压推出，因此操作时必须小心，尤其是当样品中含有危险物质时。由于有可能产生气态溶胶，该程序必须在保护通风橱内进行。

⑭在对匀浆液离心或是后续操作之前，必须先温和地搅动，以消退泡沫。

⑮关闭出口，但不要拧得太紧。

⑯关闭氮源。所需的有效压力在表3.6中示出。

注意：没有经验的工作者处理高压气体时必须在使用汽缸前寻求专家的帮助

氮舱减压法的特征如下：

①这是一种匀浆或分离细胞组分的温和方式，因为它施加于酶和亚细胞组分的化学和物理压力与其他超声波和机械匀浆的方式相比，是最小的。例如，从大多数类型的细胞中均可释放出功能完整的核和线粒体。

②与许多依赖压力和摩擦力的细胞裂解方法不同的是，氮减压膨胀法不会产生热，因为这种方法通过隔热膨胀来冷却样品，而不是加热它。因而，蛋白和细胞器没有热损伤。

③通过使用惰性气体氮气，可以保护任何不稳定的组分免于被氧化，而且氮气不会改变悬浮介质的pH值。

④该过程快速并且均一，因为在每个细胞上和整个样品中施加了同样的破坏力，保证可重复产生无细胞的匀浆液。

⑤大多数的市售产品都适用于很大的样品体积范围（如从约1ml到1L或更多）。注意：因为要产生高压，应在保护遮蔽物后进行操作。