32 P 标记裂解培养细胞实验——SDS煮沸法裂解细胞

2019.4.05

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实验材料	待标记的培养细胞固相化金黄色葡萄球菌（可选）
试剂、试剂盒	37℃标记培养液 1 Ci／ml H3(32)PO4(溶于 HCl)冰冷 Tris 平衡盐水(TBS) ／磷酸盐平衡盐水(PBS)SDS裂解缓冲液 RIPA 校正液免疫沉淀洗液
仪器、耗材	橡皮细胞刮子 Sorvall 冷冻离心机(或其他)树脂玻璃薄板／4℃ 树脂玻璃管架沸水浴
实验步骤	1. 标记和洗涤细胞（基本方案步骤1～7）。 2.1 对于贴壁细胞：加入适量 SDS 裂解液至培养皿中。35 mm 培养皿加 0.1 ml，50 mm 培养皿加 0.25 ml，100 ml 培养皿加 0.5 ml。立即用橡皮细胞刮子刮下细胞并转移至带螺口盖的微量离心管中。 2.2 对于非贴壁细胞：在涡旋混合器上短暂振荡细胞沉淀使之松散，每 5×10⁷细胞加入 1 ml SDS裂解缓冲液，再次振荡。 3. 煮沸 2～5 min，加入 4 体积的 RIPA 校正液，充分混匀。 4. 于 4℃ 以 26000 g 离心 90 min 或在冷冻离心机上以最大速度离心以澄清细胞裂解液。 5. 如常进行免疫沉淀，并用免疫沉淀洗液进行洗涤。展开
注意事项	细胞裂解液也可再加入 50 μl 固定化的金黄色葡萄球菌，于 4℃ 以 26000 g 离心 30 min 澄清。