小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养实验_胰酶消化法2

小鼠

PBS胰酶液氮

镊子平皿剪刀刮胡刀片离心管培养箱离心机移液枪显微镜

一、取得小鼠胚胎
 

1.  性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。
 

2.  每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。
 

3.  取怀孕12.5～14.5 d母鼠，断颈处死，无菌条件下暴露子宫。

4.  用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角。

5.  取出整个子宫，置于有PBS的平皿内。用PBS洗涤三次，弃除表面残余血迹。
 

6.  沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS的平皿内，充分洗涤，弃除表面红细胞。
 

7. 用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用PBS洗涤三次。
 

8. 去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤三次，充分弃除红细胞。
 

二、取得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
 

1.  用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。
 

2.  加适量胰酶，将离心管置于培养箱中10-20分钟
 

3.  取出离心管，反复吹打，加足量培养液终止消化。
 

4.  离心1000转，5分钟。
 

5.  弃掉上清，加适量培养液，反复吹打20次。
 

6. 分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞。
 

7. 置37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱培养。
 

8.  待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1：3-1：6传代。
 

9.  吸弃培养液上清。
 

10. PBS（不含钙镁）冲洗两次。
 

11.  加0.25%胰酶-0.02EDT消化。
 

12.  在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时，用移液管吹打冲洗瓶底5-6次。
 

13.  即刻加MEF培养液终止消化。
 

14. 1000转，5分钟离心。吸弃上清。
 

15.  加足培养液，吹打制成单细胞悬液，分装到各T75中。完成传代。
 

16.  原代细胞中还有少量组织块未被充分消化，在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液，组织块会逐渐消失。
 

17.  原代细胞中混有一些杂细胞，一般传到第3代时，杂细胞逐渐减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时，细胞互相交联，形态不典型。
 

三、MEF的冻存
 

1.  当细胞 90%-100% 融合时，尤其细胞少量堆聚可冷冻。
 

2.  处理方法同二的9-14，每75 cm² 的细胞 加3 ml 冻存液重悬细胞。
 

3. 每个冻存管编号加1 ml细胞悬液。
 

4. 置入程序降温盒-80℃过夜，放入液氮长期保存。
 

四、灭活MEF制备饲养层细胞
 

1.  取新的培养瓶，加0.1% Gelatin溶液覆盖预处理30分钟，用前吸掉Gelatin溶液。
 

2.  取需要处理的MEF细胞，以10ug/ml浓度加丝裂霉素（Mitomycin C）混匀。
 

3.  置培养箱中3小时。
 

4.  吸弃废液。
 

5.  用DPBS洗5遍。
 

6.  处理方法同二11-14。
 

7.  处理过的MEF加适量培养液重悬计数，以3.0x10⁴/ cm²（MEF）铺在Gelatin处理过的培养瓶上。
 

8.  置培养箱中静置过夜，使其贴壁。
 

9.  铺好的饲养层在1-7天内有效，都可以支持mES生长并维持其全能性