小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

实验概要

小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

主要试剂

75%酒精、0.05%Trypsin、SP、DPBS、细胞基础培养液
 

主要设备

35 mm培养皿、60 mm培养皿、100 mm培养皿、15 mL离心管、50 mL离心管、冻存管、眼科剪、眼科弯镊、离心机

实验材料

怀孕13.5天【将成年雌、雄小鼠放在同笼中饲养，使其自由交配，待成功交配后，以检到阴道栓的时间记为怀孕0.5天（0.5dpc）。用滴管轻触阴道口处，若有乳白色、固态胶状物即阴道栓】的小鼠（CF1品系或ICR等品系【小鼠的品种和品系很多，是实验动物中培育品系最多的动物。目前世界上常用的近交品系小鼠约有250多个，均具有不同特征。在干细胞培养中经常用到的小鼠品系有CD-1、ICR、C57BL/6等。CF1和ICR品系的小鼠产仔率高，性价比较高，并且CF1品系的小鼠来源的饲养层细胞适合培养人的胚胎干细胞。】）。

实验步骤

（1）实验准备：准备3个100 mm培养皿、2个60 mm培养皿、1个35 mm培养皿；分别加入10 mL、4 mL、1 mL未经预热的含2%～3% SP的DPBS。准备眼科剪1把，眼科弯镊2～3把（高压灭菌或75%酒精中浸泡半小时以上消毒）。
（2）断颈法【处死小鼠的常用方法之一。用单手按住小鼠头部，另一支手握住小鼠尾部向后用力拉，至小鼠颈椎脱臼死亡。】处死13.5dpc小鼠, 打开腹腔，用虹膜剪和镊子修去脂肪和系膜（用镊子将子宫轻轻拉起，使系膜和脂肪张开，然后用虹膜剪紧贴子宫将系膜与子宫分离），从输卵管根部及子宫下端分叉处剪下双侧子宫，将双角子宫于阴道处剪断。取出串珠样的子宫，放在第一个100 mm皿中。
！注意：一定注意要无菌操作，小鼠处死后用75％的酒精喷湿全身，外用手术器械和内用的器械要分开使用，外用的剪皮与剪毛的手术器械分开使用，注意不要让胚胎碰到小鼠皮毛。
（3）在第二个、第三个100 mm皿中洗去子宫表面附着的血污、脂肪结缔组织等。
！注意：尽可能的把子宫洗干净，不要残留血迹。
（4）剪开子宫壁，逐个取出胚胎放在60 mm皿里。
（5）将胚胎去除胎膜、胎盘，或者撕破羊膜取出小鼠胎儿，放在60 mm皿里。
（6）去除小鼠头、四肢、尾巴及内脏，将剩余组织放在35 mm皿中剪碎至1mm³大小。
！注意：一定要把头与内脏去除干净，防止神经细胞、血细胞等杂细胞污染。
（7）将剪碎的组织吸到15 mL离心管中，室温1000 r/min离心3～5 min，去上清。
（8）加0.05%Trypsin（约一只胎鼠0.5 mL）消化组织约20 min，消化时可持续用枪头吹打，待组织块变小，组织液变混浊后，加入和Trypsin等量的细胞基础培养液终止消化，室温1000 r/min离心3 min。
（9）弃上清，加入8 mL细胞基础培养液混匀，接种到100 mm皿中。一般一个胚胎接种到一个培养皿中，所用培养液为细胞基础培养液。
（10）将接种的细胞放在培养箱中培养，待细胞密度达到90%左右即可传代，一般2～3日可传代。