实验方法原理 | 用鸡胚制备培养鸡胚成纤维细胞。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | 无菌解剖剪无菌镊子100 cm2 无菌培养皿10 ml 注射器无菌胰酶消化瓶(带磁力搅拌棒)CO2 培养箱500 ml 烧杯纱布Sorvall 离心机250 ml 离心管150 cm2 组织培养瓶 |
实验步骤 | 1. 将 10 只 9 日龄鸡胚有空气部分朝上放置,喷上 70% 乙醇。 2. 用无菌的解剖剪将鸡蛋的顶部打开,剪掉膜上蛋壳,使膜保持完整。用无菌镊子将膜取掉。其他鸡蛋亦重复相同操作。 3. 取出鸡胚,放入无菌的 100 cm2 培养皿。 4. 剪掉每个鸡胚的头和足,将剩余的身体放入无菌的 100 cm2 平皿中,加入 10 ml 无添加剂的 MEM 培养基。通过 10 ml 注射器(5 个鸡胚/注射器)挤压,将鸡胚切碎并打人无菌的胰酶消化瓶中。 5. 加入 100 ml 37℃ 的胰酶/EDTA,并在加湿的 5% CO2 培养箱中 37℃ 持续搅拌温育 5 min。 6. 将液体从无菌胰酶消化瓶中倒人杯口带两层纱布的 500 ml 烧杯,将过滤后的液体转移至 250 ml 离心瓶中。 7. 向含有剩余组织的无菌胰酶消化瓶中加入 100 ml 新鲜的胰酶/EDTA,37℃ 温育。 8. 将消化液倒入另一个杯口带两层纱布的 500 ml 烧杯,并将过滤后的液体加入先前的 250 ml 离心瓶中。 9. 在 Sorvall RC-3B 离心机中,4℃,1200 g 离心 10 min。 10. 丢弃上清,加入 10 ml MEM-10 完全培养基,反复抽吸 10~15 次重悬沉淀,并将体积调整至 100 ml。 11. 将悬液转移至 250 ml 离心瓶中,4℃,1200 g 离心 10 min。 12. 用 5 ml MEM-10 完全培养基重悬沉淀,并将体积调整至 30 ml。 13. 将细胞悬液按每瓶 1 ml 加入到 30 个含有 30 ml MEM-10 完全培养基的 150 cm2 组织培养瓶中。 14. 37℃ 培养几天直至细胞长满,然后将培养瓶转移至加湿的 5% CO2培养箱中 31℃ 保存。 CEF 细胞培养液能够在 31℃ 保存 2~3 个星期。原代的 CEF 细胞也能直接用于病毒生长,或将胰酶处理后的 CEF 细胞冻存在液氮中留以后使用。 展开 |