抗体产生细胞的检测—溶血空斑实验

绵羊红细胞悬液Hanks液凡士林油

注射器平皿漏斗纱布研钵

1.  免疫动物

取25%绵羊红细胞悬液1毫升，无菌操作注入小鼠腹腔中。

2.  脾细胞液的制备

（1）小鼠免疫4天后，颈椎脱位处死，取脾脏，去除脂肪组织，放平皿内，用冷Hanks液洗1~2次。

（2）取出脾脏研钵中研碎，加Hanks液2~3毫升，用吸管反复吹打数次，使细胞分散。将此细胞悬液经4~8层纱布过滤，1500转/分离心5分钟，弃上清。

如细胞太多，可加蒸馏水4毫升迅速混匀，半分钟后立即加入等量Hanks液混匀1000转/分离心10分钟，弃上清。

（3）沉淀细胞用Hanks液洗1~2次，弃上清后，加Hanks液使总量达5毫升。用乳头吸管吹打使沉淀细胞悬起混匀，此即为50倍稀释的脾细胞。

（4）取此悬液0.1毫升放另一小试管中然后加0.9毫升Hanks液使成500倍稀释的脾细胞悬液。

3.  玻片小室的制作

取洁净（无油）的载玻片，按下图粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端作为注入细胞混合液。

图1  玻片小室示意图

4.  细胞混合液的配制

取小试管一只，用1毫升吸管吸取0.2毫升指示细胞悬液，用另一吸管吸取0.2毫升500倍稀释的脾细胞悬液，混匀即为被检的细胞混合悬液。

5.  混合细胞的灌注

用100ul的微量加样器吸取被检细胞混合悬液，于小室开口一端轻轻将液体注满小室（勿使气泡产生，勿使液体外溢），记录实际注入的细胞悬液微升数（约70 ul）

每个样品注2个小室，取其平均值。

6.  用牙签粘取少许凡士林益封小室开口。

7.  将作好的标本水平置湿盒中，放37℃温箱中孵60分钟

8.  溶血空斑计数

肉眼观察空斑并计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑可在低倍镜下检查，真正的溶血空斑必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。

全脾脏中抗体产生细胞总数可依下述公式计算：

脾细胞悬液制备过程中应在冰水浴中进行。