杀伤细胞功能的检测实验

细胞系

FCS RPMI 164051Cr

培养瓶培养板CO2孵箱离心机β-液闪仪γ-计数仪

一、 效应细胞的制备

1.  NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。

2.  LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腺水）中分离的淋巴细胞（1×10⁶/ml）在含有高剂量IL-2（200~1000 ul/ml）的10%FCS RPMI 1640诱导2~5 d 而成。

二、杀伤试验
 

  主要有⁵¹Cr 4 h 释放法和³H-TdR释放法，前者操作时间短，非常敏感；后者需要无菌操作，所需时间较长。

1.   ⁵¹Cr4h释放试验

（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×10⁶/ml

（2）取1×10⁶细胞（0.5 ml），加Na₂⁵¹CrO₄ 100 uCi，37度孵育2~3 h，每15 min 轻轻振摇一次。

（3）用10%FCS RPMI 1640洗涤3次，每次800 rpm、5 min。

（4）重悬细胞浓度1×10⁵/ml。

（5）96孔v型或U型培养板中，每孔加100 ul（1×104细胞），设3个复孔。

（6）每孔加入100 ul 不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100 ul 1%Triton X-100；自然释放组加100 ul 完全培养基。

（7）200g离心1 min。

（8）37度、CO₂孵箱培养4 h。

（9）200 g 离心1 min。

（10）每孔取出100 ul 上清，β计数仪测定值。

（11）计算：特异性杀伤率（%）=（实验组cpm-自然释放cpm）/（对照组-自然释放cpm）

2.  ³H-TdR释放试验
 

（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×10⁶/ml，加³H-TdR 20 uCi。

（2）7度孵育2~3 h。

（3）用10%FCS RPMI 1640洗涤3次，每次800 rpm、5 min，调整浓度为1×10⁵/ml。

（4）96孔U型或平底培养板中，每孔加100 ul（1×10⁴细胞），设3个复孔。

（5）每孔加入100 ul 不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100 ul 1%Triton X-100；自然释放组加100 ul 完全培养基。

（6）CO₂孵箱培养18~24 h。

（7）每孔取出100 ul 上清，加入胰蛋白酶（终浓度0.15%）和DNA酶（终浓度为0.0125%）

（8）继续孵育30 min。

（9）用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。

（10）烤干后，β计数仪测定值。

（11）计算：特异性杀伤率（%）=（1-实验组cpm/对照组cpm）×100%

1.  每次试验最好取3~4个不同的效应细胞/靶细胞比例，常用效靶比例为100：1、50：1、25：1、12.5：1。

2.  诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。

3.  避免同位素污染。

根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，常用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞（见表）。
 

1个溶解单位（Lyticunit，LU）为一定效应细胞30%溶解（杀伤）5×10³/靶细胞（K562）的水平。

如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞（T细胞），因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体（ER）。具体方法是将Percoll分离的位于第2、3梯度间的细胞洗涤后，调整细胞浓度为5×10⁶/ml，移入试管，加入2 ml FCS和2 ml 1×10⁸/mlSRBC，100 g 离心5 min，29度孵育1 h，轻轻重悬细胞，叠加于3 ml Ficoll上，400 ug 室温下离心30 min，界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可大于90%。

在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用NH4Cl方法，因为后者可降低NK功能。

在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄，三周内或3月龄以上小鼠的NK水平一般很低。