标记抗体的应用技术——ELISA

BSA血清

碳酸盐缓冲液PBS蒸馏水磷酸枣柠檬酸四甲基联苯胺

塑料板ELISA检测仪加样器滴头毛巾洗涤瓶烧杯玻璃棒试管吸管量筒冰箱孵育箱

一、用于检测未知抗原的双抗体夹心法

1.  包被

用0.05 M PH9 牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 ml，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。

2.  加样

加一定稀释的待检样品0.1 ml于上述已包被之反应孔中，置37 ℃孵育1 小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

　　
3.  加酶标抗体

于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1 ml。37 ℃孵育0.5～1 小时，洗涤。

　　
4.  加底物液显色

于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 ml，37 ℃10～30 分钟。

　　
5.  终止反应

于各反应孔中加入2 M硫酸0.05 ml。

　
6.  结果判定

（1）可于白色背景上，直接用肉眼观察结果。

反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

（2）可测OD值

在ELISA检测仪上，于450 nm（若以ABTS显色，则410 nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

二、用于检测未知抗体的间接法

1.  用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10 μg/ml，每孔加0.1 ml，4 ℃过夜。次日洗涤3 次。

2.  加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1 ml于上述已包被之反应孔中，置37 ℃孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）

3.  于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗体）0.1 ml，37 ℃孵育30-60 分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。

4.  其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

1.  正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

　　
2.  在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括

　　
（1）固相载体的选择

许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

　　
（2）包被抗体（或抗原）的选择

将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4 ℃18～24 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10 μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10 μg/ml。

　　
（3）酶标记抗体工作浓度的选择

首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定。然后再固定其它条件或采取“方阵法“（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

　　
（4）酶的底物及供氢体的选择

对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H₂O₂在临用前加入。