一、用于检测未知抗原的BA-ELISA
1. 包被抗体
用0.05 M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释,在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1 ml,4 ℃过夜(18-24小时)。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3 分钟(简称洗涤,下同)。 2. 加样
加入待检样品(未知抗原)或作适当稀释的标准参考品于反应孔中,同时作空白孔,阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 小时,洗涤。 3. 加B-Ab
已作适当稀释的生物素化抗体(B-Ab),加于每孔0.1 ml,37 ℃孵育30~60 分钟。洗涤。 4. 加A-HRP
已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素(A-HRP),于每孔加0.1 ml,37 ℃孵育30~45 分钟。洗涤4 次。 5. 底物显色
于上述各反应孔中加入临时配制的TMB(或OPD)底物应用液0.1 ml,于37 ℃10~30 分钟。再加2 M H2SO4 0.05 ml以终止反应。 6. 结果判定
目测或在ELISA比色仪上测OD值。 二、检测未知抗体的BA-ELISA程序 1. 包被抗原
用0.05 M PH9.6 碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释,于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1 ml,4 ℃18-24 小时。用洗涤缓冲液洗3 次,每次3 分钟。 2. 加样
加适当稀释的待检样品(未知抗体)于反应孔中,同时作空白、阴性和阳性对照孔。37 ℃孵育1 小时,洗涤。 3. 加B-Ab2
加稀释过的生物素化抗抗体(抗人或鼠等的IgG),每孔0.1 ml, 37 ℃30-60 分钟,洗涤。 4. 余下步骤同测未知抗原的BA-ELISA。 展开 |