质粒的制备实验——碱裂解法

pUC18大肠杆菌

LA培养基异丙醇水乙醇

无菌牙签移液枪震荡器Eppendorf管离心机超净台

1.   取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37 ℃过夜培养；

2.   用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37 ℃摇床~250 r/min过夜培养；

3.   吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；

4.  溶液m4. 加入300 μI振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 

5.   加入300 μI溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；

6.   加入300 μI溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；

7.   12000 g离心10分钟；

8.   吸取800 μI上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；

9.   12000 g 常温离心15分钟；

10.   倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；

11.   室温放置或超净台上风干DNA；

12.  加40 μI灭菌超纯水或TE溶解；

13.   质粒、BAC的质量检测，于-20 ℃保存。

1．溶液工与溶菌液充分摇匀，用力适当。因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，一般可用力振荡几次。

2．加入SDS后则要注意不能过分用力振荡，温和混匀，但又必须让它反应充分。

3．加入溶液Ⅱ混匀之后，一定要在冰上放置，不要摇动，对于溶液Ⅲ同样处理。

4．干燥DNA时应采用室温自然使乙醇挥发来干燥DNA，不使其过度失水，保持湿润状态。

来源《微生物学实验》