冰冻切片免疫荧光

实验概要

冰冻切片免疫荧光

实验原理

抗原抗体结合

主要试剂

固定液、梯度蔗糖、磷酸盐缓冲液、封闭液、一抗、荧光标记的二抗、DAPI、荧光抗淬灭封片剂

主要设备

冰冻切片机、荧光显微镜或激光共聚焦显微镜

实验材料

组织切片

实验步骤

切片
1.提取新鲜组织置于4%多聚甲醛中固定；
2.梯度蔗糖脱水：10%-20%-30%；
3.冰冻包埋剂包埋并切片，切片厚度4~10μm;
4.-20℃保存切片并尽快染色以防止蛋白降解；
 
染色
1.冰冻切片取出复温至室温，或用烤片机烤干切片表面水分；
2.丙酮或多聚甲醛固定5-10min;
3.PBST洗5 minx3次;
4.（可选）抗原修复可选；
5.（可选）0.1% Triton-100X透膜；
4.加山羊血清封闭液或3%BSA封闭30min;
5.弃去封闭液，滴加相应抗体（1%BSA稀释），保湿盒中4℃过夜；
6.PBST洗 5 minx3次; 
7.滴加二抗，避光，37℃，1-2 h；
8.PBS洗 5 minx3次； 
9.DAPI染色 5 min； 
10.PBST洗 5 minx3次；
11.滴加抗淬灭封片剂并用盖玻片封片；
12.荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察并拍照。