实验概要
本实验用福林酚法(Folin—酚试剂法)测定了蛋白质的含量。
实验原理
Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这个方法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时较长,要严格控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团,如 -CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应,而且对后者的影响还要大得多。此外,酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。
Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠,氢氧化钠,硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下,与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用,生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下,易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应,其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg蛋白质。
主要试剂
Folin—酚试剂:
1. 试剂甲
1) 4%碳酸钠溶液
2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液
3) 1%硫酸铜溶液
4) 2%酒石酸钾钠溶液。
临用前将(1)与(2)等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。(3)与(4)等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合,即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制,一天内有效。
2. 试剂乙
称钨酸钠100g,钼酸钠25g置2000mL磨口回流装置内,加蒸馏水700mL,85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀,使其溶解。小火加热,回流10h(烧瓶内加小玻璃珠数颗,以防溶液溢出),再加入硫酸锂(LiSO4)150g,蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min,以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL,过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液,此液应为鲜黄色,不带任何绿色。置棕瓶中,可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久,颜色由黄变绿,可加几滴液溴,煮沸几分钟,恢复原色仍可继续使用。
试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液(1mol/L左右),以酚酞为指示剂,当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右,将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。
主要设备
1. 试管1.5×375px(×6)
2. 试管架
3. 移液管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1)
4. 恒温水浴
5. 分光光度计
实验材料
1. 标准蛋白质溶液
结晶牛血清白蛋白或酪蛋白,预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量,根据其纯度配制成150μg/mL蛋白溶液。
2. 待测蛋白质溶液
人血清,使用前稀释150倍。
实验步骤
1. 制作标准曲线
取7支试管,按下表平行操作:
试管编号 试剂处理 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
标准蛋白质溶液(mL) | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸馏水(mL) | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
Folin-酚甲试剂(mL) | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
摇匀,于20—25℃放置10min | |||||||
Folin- 酚乙试剂(mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
迅速摇匀,30℃(或室温20—25℃)水浴保温30min,以蒸馏水为空白, 在640nm处比色。 | |||||||
A640 |
绘制标准曲线:以A640值为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。
2. 未知样品蛋白质浓度测定
取2支试管,按下表平行操作:
试管编号 试剂处理 | 空白管 ×2 | 样品管 ×2 |
血清稀释液 (mL) | 0 | 0.2 |
蒸馏水 (mL) | 1.0 | 0.8 |
Folin-酚甲试剂(mL) | 5.0 | 5.0 |
摇匀,于20—25℃放置10min | ||
Folin-酚乙试剂(mL) | 0.5 | 0.5 |
迅速摇匀,30℃(或室温20—25℃)水浴保温30min,以蒸馏水为空白,在640nm处比色。 | ||
A640 |
3. 计算
注意事项
1. Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定,而Folin-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当Folin-酚乙试剂加入后,应迅速摇匀(加一管摇一管),使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。
2. 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内,若超过此范围则需将血清酌情稀释。
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