蛋白质的定量测定——福林酚法(Folin—酚试剂法)

实验原理

Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团，如 -CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应，而且对后者的影响还要大得多。此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。

Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg蛋白质。

试剂和器材

一、试剂

Folin—酚试剂:

试剂甲：

1) 4%碳酸钠溶液

2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液

3) 1%硫酸铜溶液

4) 2%酒石酸钾钠溶液。

临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。

试剂乙：

称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。

试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。

二、标准和待测蛋白质溶液

1. 标准蛋白质溶液

结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150μg/mL蛋白溶液

2. 待测蛋白质溶液

人血清，使用前稀释150倍。

三、器材

试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温水

浴；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取7支试管，按下表平行操作：

绘制标准曲线：以A640值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度测定

取2支试管，按下表平行操作：

三、计算

注意事项

(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。

(2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。