碘克沙醇及Ficoll-400分离纯化大鼠胰岛细胞的效果对比

实验概要

本实验的目的是分别使用碘克沙醇和Ficoll-400密度梯度液纯化大鼠胰岛细胞， 比较两者分离纯化大鼠胰岛细胞的收获量、纯度、活性和功能。主要方法为将20只SD大鼠随机分为碘克沙醇纯化组和Ficoll-400纯化组，以胶原酶P消化分离SD大鼠胰腺，分别采用碘克沙醇及Ficoll-400密度梯度液来纯化胰岛细胞。通过DTZ染色，计数胰岛细胞的数量和纯度，用胰岛素释放试验和胰岛移植评估胰岛细胞的功能。

主要试剂

胶原酶P溶液(Roche公司)，碘克沙醇工作液 (EZ-SepTM，达科为公司产品)，HCA液(上海长征医院产品)，RMPI1640培养液(Gibco公司)，新生小牛血清(杭州四季青公司)。

主要设备

冷冻离心机(上海安亭)，电子密度计(梅特勒公司)。

实验材料

♂SD大鼠，体质量200-250 g。20只SD大鼠随机均分为2组：碘克沙醇组及Ficoll-400组；两组分别使用碘克沙醇-HCA或Ficoll-400-HCA作为密度梯度液来分离纯化胰岛细胞。

实验步骤

1. 胰岛细胞的分离纯化

SD大鼠通过戊巴比妥钠[按30  mg/(kg·w)]腹腔内注射麻醉，取腹壁正中切口打开腹腔，将4℃ 0.5 g/L的胶原酶P溶液(Roche公司)约8-10  mL缓慢经胆总管逆行注入胰管内，使胰腺充分膨胀，迅速摘取完整胰腺，置入预温至带有小玻璃珠的38℃  Hanks液小瓶中，在38℃水浴锅中静止消化约10-12 min后，轻柔振荡1-2  min或以玻璃吸管轻柔吹打胰腺使胰腺组织均匀分散呈泥沙状，将胰腺消化物悬液以40目不锈钢筛网过滤以去除淋巴结、导管及血管等组织，然后迅速加入装有40  mL 4℃含200 mL/L小牛血清的RMPI1640培养液(Gibco公司)的离心管中，低速(800 r/min)离心洗涤2次。
2. 胰腺消化物的孵育

将上述所得之胰腺消化物按1∶3比例加入4℃含200   mL/L小牛血清的HCA器官保存液混匀，取样分别行双硫腙(DTZ)及碘化丙啶/亚啶橙(PI/AO)染色计算纯化前胰岛细胞团的产量及活率。将胰腺组织孵育液置0-4℃冰浴中孵育10  min，每隔2 min对孵育液进行轻微振荡以免胰腺消化物黏结。
3. 胰岛纯化

   1) 碘克沙醇组：将10  mL孵育好的胰腺消化物悬液离心去上清后与5  mL碘克沙醇工作液[EZ-SepTM，自行用电子密度计以HCA液(上海长征医院产品)调整其密度为1075 g/L，渗透压280±15  mOsm/L，达科为公司产品]充分混匀后加入含1090 g/L碘克沙醇-HCA液10  mL的推进式离心管中，置4℃立式冷冻离心机，设置离心力为500 g，离心5 min; 收集两层密度梯度液之间悬浮的细胞层；

   2) Ficoll-400组：将10  mL孵育好的胰腺消化物悬液离心去上清后，与5 mL 200 g/L的Ficoll-400-HCA液(Sigma)充分混匀后，加入含10 mL  250 g/L Ficoll-400-HCA密度梯度液的推进式离心管中，置4℃立式冷冻离心机500 g，离心5  min；用活塞推出20%与25%层面交界部位的细胞层; 两组收集的细胞均以4℃含100 mL/L小牛血清的RMPI1640培养液1200  r/min离心洗涤2遍，纯化胰岛细胞取样鉴定。
4. 胰岛细胞鉴定

收集纯化胰岛细胞，取样行DTZ染色后解剖镜下计数并观察纯化后胰岛细胞团的形态，计算得率[胰岛细胞团数量以胰岛细胞当量来计算(IEQ)]及纯度(纯度 = DTZ染色阳性的胰岛个数/细胞团总数).
5. 纯化后胰岛细胞的活力测定

将胰岛制备物与碘化丙啶/亚啶橙储备液混合10 min，在荧光显微镜下用490 nm激发光滤光片，510 nm光栅滤光片观察。胰岛活细胞发出绿色荧光，死细胞发出红色荧光。胰岛细胞活率用胰岛活细胞占所有胰岛细胞总数的百分比表示。
6. 胰岛分泌功能的测定

分别从两组手工挑取50个直径在150-200 μm之间的胰岛细胞，加入含100 mL/L胎牛血清、10 mmol/L HEPES、3.3 mmol/L葡萄糖的RMPI1640培养液2 mL中，置于34℃，50 mL/L CO₂的培养箱中6  h，留取上清液标本后，弃去所有上清液；再加入2 mL含16.7 mmol/L葡萄糖的RMPI1640培养液，继续培养6  h，分别检测两者培养液上清的胰岛素含量，胰岛素测定采用间接放射免疫法(放射免疫测量药盒大鼠胰岛素放免试剂盒，美国Linco公司)。
7.  大鼠糖尿病模型的制备随机选取Wistar大鼠，分笼饲养，禁食过夜，测定空腹血糖。用柠檬酸缓冲液(pH4.2-4.6)配制10  g/L的链脲佐菌素(STZ)，由阴茎背静脉注入[按60 mg/(kg·w)]。连续观察空腹血糖变化，血糖浓度每3  d测定1次，连续两次高于16.8 mmol/L者定为糖尿病模型。
8. 大鼠胰岛细胞移植

与供体胰岛相对应将Wistar糖尿病成模大鼠随机分为碘克沙醇组和Ficoll-400组以及对照组，每组5只，在碘克沙醇组和Ficoll-400组的糖尿病成模大鼠的双侧肾包囊中植入纯化后的SD大鼠胰岛细胞团1000个IEQ，对照组糖尿病大鼠肾包囊内注射1  mL Hanks液。移植后每隔1 d测血糖、尿糖1次，非空腹血糖连续低于11.2  mmol/L及尿糖阴性，作为移植物功能存活的标准；否则作为移植物受排斥、功能丧失的指标。
 9. 统计学处理

应用SPSS10.0软件进行统计分析，数据以mean±SD表示，具体统计方法采用配对t检验(Paired-Samples T Test)方法。