利用碘克沙醇梯度溶液分离动物细胞核

实验概要

本实验使用碘克沙醇密度梯度溶液从动物肝脏中分离纯化了动物细胞核。

主要试剂

1. OptiPrepTM(600g碘克沙醇，ρ=1.32g/ml)；

2. OptiPrepTM稀释剂(OptiPrepTM diluent，OD)：150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl₂、120mmol/L三甲基甘氨酸-KOH，pH7.8；

3. 匀浆介质(HM)：0.25mol/L蔗糖、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl₂、20mmol/L三甲基甘氨酸-KOH，pH7.8；按要求向OptiPrepTM稀释剂和匀浆介质中加入蛋白酶抑制剂。

主要设备

1. 高转矩桥式电动机(半导体开关控制)；

2. Potter-Elvehjem匀浆器，20—40ml，孔隙约0.07mm；

3. 高速离心机，带可容纳15—50ml离心管的吊桶式转子；

4. 注射器，带金属套管针(内径约0.8mm)；

5. 尼龙滤网。

实验材料

新鲜的小鼠肝脏。

实验步骤

1. 制备500g/L碘克沙醇工作液：每5倍体积OptiPrepTM用1倍体积的OptiPrepTM稀释剂来稀释；

2. 梯度溶液：用匀浆介质(分别为6倍体积加4倍体积和7倍体积加3倍体积)来稀释500g/L碘克沙醇工作液以制备300g/L和350g/L的两种碘克沙醇梯度溶液。保持于冰上。

3. 切除肝脏并用剪刀剪切成微小碎块；

4. 将大约一半肝脏转移到Potter-Elvehjem匀浆器的20ml匀浆介质中，并用研杵研磨约8次，在约500r/min转速下旋转以破碎组织；

5. 对另一半肝脏切碎物重复以上操作；

6. 用尼龙滤网过滤；

7. 通过与等体积的500g/L碘克沙醇工作液混合将匀浆液调整到250g/L碘克沙醇；

8. 将10—15ml匀浆液转移到50ml管中，从300g/L和350g/L的碘克沙醇梯度溶液中各取10ml加到匀浆液之下；

9. 在100000g下离心20min；

10. 细胞核在300g/L和350g/L碘克沙醇界面上成带，用注射器和金属套管针吸取细胞核；

11. 用2倍体积的匀浆介质稀释悬液，在2000g下离心10min沉淀细胞核。

注意事项

所有操作在0—4℃下进行。