实验概要

本实验用突变的VlCDR3构建了SCFv基因文库。

主要试剂

1. 去离子水(Millipore)

2. VentDNA聚合酶和缓冲液(NEB)

3. 20XdNTP(每种浓度5mmol/L)(NEB)

4. 琼脂糖胶盒

5. Geneclean试剂盒(QbiOgene)

6. 含有起始scFv基因的质粒DNA

7. LMB3引物(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’)，10pmol/ul

8. VLFOR随机引物，10pmol/ul

主要设备

PCR热循环仪

实验步骤

1．设计合成含有CDR3随机化序列的V_LFOR引物。当然，此引物必须以拟进行亲和力成熟的抗体V_L基因作为基础进行设计。本实验中，V_LCDR3的7个氨基酸被随机化。在每个随机化位点中，保留了大约50％野生型氨基酸。引物设计结果如下：

V_LFOR随机引物：5’-CCC TCC GCC GAA CAC CCA ACC 524 513 524 524 542 541 511 CTG GCA GTA ATA ATC AGC CTC-3’

数字对应摩尔分数如下。

   1) A(70％)、C(10％)、G(10％)、T(10％)。

   2) A(10％)、C(70％)、G(10％)、T(10％)。

   3) A(10％)、C(10％)、G(70％)、T(10％)。

   4) A(10％)、C(10％)、G(10％)、T(70％)。

   5) G(50％)、C(50％)。

利用分子建模去识别哪个CDR3残基具有溶剂可接近侧链，来确定随机化残基。

2．配制4个50w1 PCR反应混合液，包含：

   1) 去离子水，35.5ul

   2) 20XdNTP，2.5ul

   3) 10XVent聚合酶缓冲液，5.0ul

   4) lMB3引物(10pmol/ul)，2.5ul

   5) VI-FOR引物 (10pmol/ul)，2.5ul

   6) 野生型scFv基因模板DNA(100ng)，1.0ul

   7) VentDNA聚合酶(2单位)，1.0ul

3．在有加热盖的热循环仪内加热混合液到94℃，5分钟。

4．以94℃1分钟、42℃1分钟、72℃2分钟的条件共循环30次，扩增V_L基因。

5．在1％琼脂糖胶上胶纯化V_L基因(接近800bp)；用Geneclean试剂盒提取DNA。将每种产物重悬于20ul水中。在1％琼脂糖凝胶上与已知大小和浓度的标准对照品比较，测定DNA浓度。