成纤维细胞生长因子(FGF)是最大的一类中胚层和上皮细胞生长分化多肽因子家族。FGFs在许多生物学过程中发挥重要作用，比如胚胎发育，伤口愈合，血细胞生成及血管发生等。此外，已有研究表明FGFs可以增加多种肿瘤细胞的浸润性，如前列腺、膀胱、肾脏、乳房、胰腺等部位肿瘤。
目前，共发现20多种FGFs，对不同类型细胞具有不同的作用。但是，只发现了5种FGF受体(FGFR)。在蛋白水平上，这些受体具有55%-72%的同源性。FGFR结构包括一个胞外配体结合区域，一个跨膜区域以及一个胞内激酶区域。配体结合区域包含三个不同的类似免疫球蛋白结构域(称为免疫球蛋白I，II和III)。FGFR1-3 mRNA的不同的剪接作用形成两种亚型α和β。其中FGFR3具有两种不同的突变体IIIb和IIIc。这两种变体具有不同的亲和活性：IIIc分布更加广泛，能和多种FGFs结合(FGF1，FGF2，FGF4，和FGF9)；IIIb优先和FGF1结合，能够较低程度和FGF8和FGF9结合。在有肝素(heparin)作用的情况下，FGFs和FGFRs结合后，FGFs诱导受体二聚化，引起胞内激酶区域的自身磷酸化以及下游信号级联反应的激活。配体受体结合后，FGFs会启动多种信号转导途径：胞内钙离子水平升高，诱导丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C通路，激活腺苷酸环化酶以及诱导原癌基因c-myc 和c- fos。
已发现FGFR3会发生特殊突变，导致其酪氨酸激酶活性激活，引起一些与骨骼发育，多发性骨髓瘤，颈部肿瘤以及膀胱肿瘤相关的综合征。最近的研究发现FGFR信号是前列腺肿瘤细胞在体外存活所完全必需的。近来，FGFR3已被作为多发性骨髓瘤的可能治疗性靶点。尽管已有确实证据表明激活的FGFR3突变存在于肿瘤组织中，但是关于FGFR3在肿瘤组织中的表达知道的非常少。近来，使用基因芯片技术对基因表达分析后，发现和正常组织相比FGFR3在膀胱肿瘤样品中过表达。基因表达水平通过Western blot和免疫组化分析在蛋白水平上进一步确证。事实上，这种蛋白的过量产生在过渡性肿瘤中似乎比基因突变更容易发生。所有这些数据都表明FGFR3可能是一个非常有吸引力的泌尿外科肿瘤的治疗性靶点。膀胱肿瘤是生殖泌尿系统第二个最常见的恶性肿瘤之一。大约40%-50%的膀胱肿瘤表现出FGFR3基因发生突变；表皮肿瘤发生的概率(80%)比浸润性肿瘤更大。
随着人们对FGFR3作为不同肿瘤治疗性靶点的兴趣越来越大，以及进来发现它在过渡细胞瘤中的过度表达，我们已开始使用噬菌体展示技术开发用于治疗的人源抗体。噬菌体抗体展示是目前最好的一个开发用于研究，临床以及治疗用途人源抗体的方法。但是，对于抗体开发来说，FGFR3分子非常难以琢磨，因为小鼠和人的FGFR3同源性非常高(92%)。仅最近，有报道通过使用一个库容非常大(2.1*1010)的商业化Fab库，开发出针对一个FGFR3亚型的Fab片段。在我们的试验中，我们使用了两个公开的scFv抗体库Tomlinson
I + J (MRCGeneservices, Cambridge, United
Kingdom)。两个库的库容都大概在1.4*108。scFvs相比IgG以及Fabs具有更好的肿瘤浸润性，能够更快速被清除，同时具有更好的特异性。在这篇报道中，我们已经筛选出了一些对FGFR3a的亚型IIIc具有特异性的人scFv抗体。这些抗体通过FACS证明可以和膀胱肿瘤细胞系RT112发生反应，并且抑制细胞增殖，具有进一步用于治疗的潜力。
材料和方法
细胞系、蛋白、抗体：
RT112，HEK293；重组人FGFR3a（IIIc）/Fc，FGFR1a（IIIc）/Fc，FGF9，FGF1以及表皮生长因子。鼠抗人FGFR3单克隆抗体，羊抗人IgG（Fc特异性），鼠抗c-myc单克隆抗体，微管蛋白抑制剂；HRP-抗c-myc抗体，抗6His抗体，抗M13抗体，HRP-抗M13单克隆抗体，FITC-兔抗鼠IgG，R-藻红蛋白羊抗鼠IgG，鼠IgG
TrueBlot。
FGFR3 cDNA克隆和细胞转染
FGFR3的胞外区域和人IgG的Fc C端融合表达，构建表达载体pcDNA3.1-FGFR3(IIIc)WT-Fc和pcDNA3.1-FGFR3(IIIc)S249C-Fc。然后，转染HEK293T细胞。免疫印迹法和FACS检测蛋白表达和活性。
从噬菌体库筛选FGFR3特异性scFv抗体
人scFv噬菌体库Tomlin-son I + J，辅助噬菌体KM13，E.coli TG1和HB2151。分别单独培养两个噬菌体库，然后1:1混合噬菌体用于筛选。按照示意图1所示，进行噬菌体库筛选和scFv表达。第一轮筛选，使用1ug FGFR3或人IgG蛋白包被微孔板。噬菌体先和人IgG孵育1小时去除可以和Fc发生反应的噬菌体；再和FGFR3包被的孔孵育2小时。最后，微孔板使用0.1%PBST洗涤10遍(下一轮筛选洗涤20遍)，使用100ul胰蛋白酶处理微孔板，洗脱结合的噬菌体。洗脱获得的噬菌体按照Goletz等描述的方法进行另一轮的淘选。
图1：噬菌体库筛选FGFR3特异性scFv抗体流程图
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