实验概要
Northern杂交采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。
主要试剂
1. 0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2O至80ml, 调pH至8.0, 定容至100ml。
2．50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振荡, 37℃过夜，高压灭菌。
3． 5×甲醛凝胶电泳缓冲液: MOPS [3-(N-玛琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml, 用2N NaOH调pH至7.0, 再加入0.5M EDTA 10ml, 加DEPC H2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。
4． 20×SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。
5. 6×SSC: 20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。
6．50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,无菌抽滤、分装。
7．1M Na2HPO4: Na2HPO4•12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4: NaH2PO4•2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 6.6): Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE缓冲液: 1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml，加dd H2O至250ml。
11.预杂交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml（pH6.6）,10%SDS 1ml, 总体积 20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA（10mg/ml）,使终浓度为4μl/ml。
12. DEPC H2O: 1000ml ddH2O中加入DEPC 1ml，充分振荡，37℃过夜，高压灭菌。
实验步骤
1. 总RNA提取
2. 变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC H2O 12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。
3. 样品制备：取总RNA 30μg，加入甲醛4.0μl、甲酰胺12.5μl，上样缓冲液2.5μl。65℃温育15min，迅速冰浴5min。然后加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液 4.0μl
4. 电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。以1×甲醛凝胶电泳缓冲液为电泳液，电泳结束后转膜。
5. 将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：
（1）．在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC（20×SSC用DMPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。
（2）．构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。
（3）．用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。
（4）．剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无RNase的水中浸泡5min.，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。
（5）．取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20×SSC浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜4～6小时或4℃过夜。
在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20×SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。
（6）．拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。
(7)．取下凝胶，用2×SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。
(8)．交联：将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外透射仪照射3min。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。
6. 探针标记(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
（1）取模板DNA 25ng于0.5ml离心管中，95-100℃变性5min，冰浴5min。
（2） dNTPmix的制备: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。
（3）将下列反应成份混合，加入上述微量离心管中：
dNTPmix 2.0μl
BSA(10mg/ml ) 2.0μl
5×buffer 10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP 5.0μl
加入适量dd H2O使反应总体积达50μl，轻轻混匀。室温下反应1hr。
7.预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交过夜。
8.杂交：将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）加入到预杂交液中，42℃杂交16hr。
9.洗膜：
(1)倾去杂交液。
(2)2×SSC/0.1%SDS，42℃洗10min。
(3)1×SSC/0.1%SDS，42℃洗10min×2次。
10.压片：将膜用dd H2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影一星期左右。
注意事项
(1)．操作时必须仔细、小心，严格按同位素操作规程进行，以防止同位素污染。
(2)．膜的重复使用：结合了待测RNA的膜与探针杂交后，可经碱或热变性方法将探针洗脱，膜可反复使用与其它探针杂交。方法如下：杂交的膜（注意：杂交过的膜在保存过程中不能干燥，否则探针将会与膜形成不可逆的结合）置含1% SDS的沸水中自然冷却至室温后，将膜放入双蒸水中漂洗2-3遍。取出膜，用滤纸吸去膜表面的水份。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好，室温下真空保存。
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