实验概要
1. 掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。
2. 观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。
实验原理
1. 产甲烷菌：
厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。产甲烷菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，产甲烷菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
2. 产甲烷菌的发现历史：
自1901—1903年巴斯德研究所的马载（Maze）第一次观察到一种产甲烷菌的微球菌（马氏甲烷球菌）以来，迄今共发现了五十多种产甲烷菌。1974年Bryant提出产甲烷菌这一名词，为避免这一类细菌与氧化甲烷的好氧菌相混淆。1979年由Balch
W.E.等人根据菌株间16SrRNA降解后各寡核苷酸中碱基排列顺序间相似性的大小，提出了一个新的系统分类方法，共分为3个目、4个科、7个属、13个种。
3. 定义、性质及分布：
产甲烷菌（Mathanogens）是一类必须生活在厌氧生境下并伴有甲烷产生的古生菌，其形态和生理、生化特性呈现明显的多样性。它生长的氧化还原电位约为-0.33V，最适生长温度为35—40度，最适pH为6.0-7.2。例如细胞形态有球状、短杆状、长杆状、螺旋状和丝状等；Gram染色反应有阳性、阴性和不定性；生长所需碳源约有10多种，除CO2外，还有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有当产甲烷菌在利用H2作CO2还原剂以产生生物合成所需细胞物质，才能利用CO2作电子受体以产生ATP和CH4。
产甲烷菌广泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和动物的肠道、昆虫的肠道、湿树木、地热泉水、深海火山口、水田和海洋的沉积物、沼泽等厌氧环境中都有产甲烷菌存在。
4. 产甲烷菌的培养：
在培养产甲烷菌时，最需要控制的是厌氧条件，在pH=7.0，O2的浓度与1atm的氧平衡时，O2——O2-反应的电位是0.81V，因此，在-0.33V时，O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。每升饱和了空气的水中含有1.48×10-55个O2。所以说，要保证产甲烷菌培养时的低电位是很重要的。
产甲烷菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术 因此他是世界上第一个分离纯化产甲烷菌的人。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌种都不会干扰厌氧条件。
主要试剂
培养基：改良的PRAS无氮培养基
[配方组成——NH4CL 1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4 0.2g,甲酸钠5g,乙酸钠5g,甲醇3.5ml,Ph值为7.0,蒸馏水1000ml,1%的树脂刃天青（还原指示剂）1ml,121摄氏度灭菌20min.使用前每5ml培养基加入1%Na2S（还原剂）和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液（抑制剂）各0.1ml]
糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基（液体）；
冰块 Na2S NaHCO3;
乙醚 吲哚试剂 卢戈氏碘液；
主要设备
高纯氮气 厌氧管 厌氧手套箱 注射器 恒温培养箱 铜柱除氧系统 定量加样器 厌氧罐 超声波破碎仪 酒精灯 冰块 水浴锅 记号笔 振荡器
实验材料
菌种：
待测样品
已分离纯化的产甲烷菌（Mathanogens）；
实验步骤
1. 分离与培养
(1) 铜柱系统除氧
铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2 和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。
(2) 预还原培养基及稀释液的制备
在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，于灭氧罐中灭菌备用。
(3) 分离
1) 编号
取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。
2) 稀释
在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不同样品稀释液。通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。
3) 滚管分离
a 滚管
将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，当培养基从瓶中取出时，要用N2在培养基内中充气。再在试管中用N2充气，赶走所有管内空气，然后把培养基加入管内，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内，及时拔出充气针头。用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。
b 分离纯化
生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养，培养24h或更长时间或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。
c 划线分离
将试管橡皮塞的一端在火焰上灼烧一下，挨着打气针塞住管口，在针头快速取下前，通气15-20s，管口一端在火焰上烧片刻。旋紧管塞，划线后的卷管直立保温，使用CO2:H2=80:20,因为CO2比空气重，开启后管塞不致有空气残留。划线后的滚管，置34-37度下培养，便可长出菌落。
(4) 镜检与计数
1) 镜检
挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。
2) 计数
液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有产甲烷菌的数量。公式如下：
产甲烷菌数量cfu/g（mL）样品=A×10ml×X/10×D
A-0.1mL滚管计数的实际平均值；
X- 镜检呈现为产甲烷菌的数目；
X/10-菌落中产甲烷菌的概率；
D- 稀释倍数
2. 菌种的鉴定
(1) 糖发酵试验
糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
具体实验步骤：
① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。
② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。
③ 24h后观察各管中液体颜色变化及产气情况。
(2) 蛋白质分解实验
① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。
② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。
③24h后各管分别进行米伦氏反应、吲哚反应、黄色反应和坂口反应等。
(3) 淀粉水解实验
① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。
② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。
③ 24h后于各管中加入适量卢戈氏碘液观察淀粉的水解情况。
注意事项
1. 注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。
2. 注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。
3. 用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。
4. 树脂刃天青（resazurin）既是还原剂又是指示剂，它可以把培养基中残留的溶解氧去除，其氧化还原电位指示敏感范围为-42mV。有氧时呈紫色或粉红色，无氧时呈无色（培养基的颜色），它是较为理想的氧化还原电位指示剂和培养严格厌氧菌不可缺少的。
5. 培养基中加入的青霉素是用来抑制其它细菌生长的，因为产甲烷菌的细胞壁成分为假肽聚糖，不受青霉素影响。
6. 注射器在使用前必须先用培养基上面的气体冲洗、填充，然后插入培养基的下层，以保证当培养基移入试管时，就处于无氧气体层的下面。
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