二苯胺法测定DNA含量

二苯胺法测定DNA含量

【实验目的】 

掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法 

【实验原理】 

DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，其反应如下图。

蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40µg ~400µg范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。


【实验材料】 
1.实验器材 
恒温水浴,721分光光度计。 
2.实验试剂 
（1）DNA标准溶液：准确称取小牛胸腺DNA10mg，以0.1mol/L NaOH溶液溶解，转移至50ml容量瓶中，用0.1mol／L NaOH溶液稀释至刻度。浓度为200µg/m1； 
（2） DNA样品液：用上述实验方法提取的DNA样品 
（3）二苯胺试剂：使用前称取1g结晶二苯胺，溶于100m1分析纯冰醋酸中，加60%过氯酸10m1混匀。临用前加入1m1 1.6%乙醛溶液。此溶剂应为无色。 

【实验操作】 
1．标准曲线的绘制 
取干燥试管6支，编号，按表所示加入试剂。

试剂
管号

0
1
2
3
4
5

DNA标准溶液，ml
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0

蒸馏水，ml
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0

二苯胺试剂，ml
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0

A595


加完毕，混匀，于60℃恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处测定吸光度，以零号管作对照，绘制标准曲线。 
2．样品测定 
取试管3支，两支为样品管，—支为对照管。对照管操作与标准曲线零号管相同。向每支样品管中加入2m1样品液及4ml二苯胺试剂，60℃保温1h，冷却后于595nm测定吸光度，以对照管调零点。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相应吸光度的DNA含量。 

【实验结果讨论】 
1．该反应灵敏度较低，但方法简便，目前仍广泛使用。 
2．其他糖及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等，对此反应由干扰，测定前应尽量除去。