cDNA文库组标准流程五:cDNA双链和载体的连接

1.连接：

根据载体和cDNA的电泳定量结果，每个样品设置3个比例的连接，

即：insert/vector=1/3  incert/vector=1/1   insert/vector=3/1

按以下体系依次加入：

      ddH₂O                      xul

T4 ligase 10x buffer       1ul

PBK(E/X)vector(20ng/ul)    1ul

cDNA                      (由浓度及连接比例而定)

T4 DNA ligase(3U/ul)       1ul

 Total                      10ul

14℃，连接过夜

2．检测：（PCR方法）

取适量PCR薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：

               连接产物  insert  vector  阳性对照   阴性对照（H₂0）

模板：            1         1      1        1           1

10xbuffer        2.5       2.5    2.5      2.5         2.5     

Mgcl₂(25mM)       1.8       1.8    1.8      1.8         1.8

DNTP(2.5mM)        1         1      1       1            1

T3 引物（10pmol）  1         1      1       1            1       

T7 引物（10pmol）  1         1      1       1            1

Taq酶            0.4       0.4    0.4     0.4          0.4

ddH₂0            16.3      16.3    16.3    16.3        16.3

total            25ul      25ul    25ul    25ul       25ul

各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上

反应程序：     94℃      4分钟

94℃      20秒

53.6℃   20秒      35个循环

72℃      4分钟

72℃      10分钟

4℃       24小时

待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder

半小时后照相，观察胶图：insert、vector、阴性三个样品除了有少量引物带（大约在200bp左右）外，均无其他带形。阳性带形清晰。好的连接产物应在500

至4、5Kb大小之内形成一条清晰的smear。