How to build a BAC library

Introduction

   The most important aspect  of our cloning  vectors is that they are
based on   the E. coli F-factor   replicon. It allows for  strict copy
number control of the clones so that they are stably maintained at 1-2
copies per cell.  The stability  of the cloned DNA during  propagation
in E. coli host is  substantially higher in  lower copy number vectors
than in multi-copy counterparts (Kim et al, NAR, 20(5):1083-1085). The
stabilizing effect of BAC and Fosmid vectors is notable especially for
certain genomic DNA that  are  normally unstable  in high  copy number
vectors.  This  includes  genomes  of Archaeal, mammalian,   or  other
origins.  Stable Fosmid libraries have been generated from the genomes
of an Archaeum and Sea urchin that  were highly unstable/unclonable in
multicopy cosmid vectors.

   The pBeloBAC11 vector allows lacZ-based positive color selection of
the BAC clones that have  insert DNA in the  cloning sites at the time
of library construction. Because the vector exist in single copy in E.
coli,     purifying  the  DNA     in     large quantity takes     some
effort. Therefore, we have been  supplying to any interested party the
vector as the E.  coli strain that carries  the vector. Please see the
experimental protocol  below to find out  how to prepare large amounts
of pure pBeloBAC DNA. The nucleotide sequence is also available.

   The pBAC108L vector is the very first  version of BAC vector. After
transformation, clones carrying human DNA insert had to be selected by
colony  hybridization with labeled human DNA.  
Click  here for its nucleotide sequence.

   The  pFOS1  vector was a single   copy cosmid vector constructed by
fusing pBAC108L and pUCcos (a pUC vector in which the region including
lacZ and   multiple  cloning   sites was    replaced  by  lambda   cos
sequence). In vivo  homologous  recombination between two vectors  via
cos sites resulted in pFOS1. The vector  is extremely unstable in most
of E.  coli strains due to the  presence of double cos  sites. pop2136
strain   (Methods in   Enzymology  vol.152 pp173-180,   1987),  for no
apparent reason,  can   maintain pFOS1 (and other    double-cos cosmid
vectors) with some stability. The    bireplicon is driven by the   pUC
replication origin,  and exists in high copies  in  E.  coli. After in
vitro packaging and transfection to E. coli,  the structure of Fosmids
is exactly the  same as  pBAC108L  clones except the size;   therefore
Fosmids are mini-BACs with 40 kb inserts. Fosmid library can easily be
constructed using the protocol for  constructing cosmid libraries with
double-cos vectors. The Fosmid system is useful for quickly generating
miniBAC  libraries from    small  amounts of   source   DNA,  such  as
flow-sorted chromosomal  DNA. Aliquots of  CsCl purified pFOS1 DNA has
always  been  made available  for  anyone  interested  in constructing
Fosmid libraries. 
Click  here for the nucleotide sequence.


   Inquiry should be forwarded to: Ung-Jin Kim or Hiroaki Shizuya.PREPARATION OF BAC VECTOR DNA   Because BAC vectors  are    single copy  plasmids, it    is  rather
difficult to obtain large amount of BAC vector DNA. Extra care is also
needed to minimize the contamination of E. coli DNA that consists more
than  99%  of the   total DNA.  However,  by  carefully following  the
procedure  provided  below,  it is  possible  to  obtain  from a liter
culture a few micrograms  of  pBeloBAC11 (7.5  kb), which  is normally
enough for library construction.


 1)Starting  from a  single  colony, grow  E.  coli strain  containing
   pBeloBAC11 vector in  3 liters of LB  +  chloramphenicol (15 ug/ul)
   with good aeration overnight.  Make  sure to take  a blue colony on
   an X-gal/IPTG plate.

 2)Harvest the cells by centrifugation, and  resuspend the cell pellet
   in Solution I (without lysozyme). Use  25 ml Solution I   per liter
   culture.

 3)Add lysozyme to 2.5mg/ml, and mix by inversion. 

 4)Add  Solution II  (50  ml  per   liter culture)  and  mix  well  by
   inversion. Leave on ice for 10 minutes.

 5)Add  37 ml  of  Solution III  per  liter  culture.   Mix gently  by
   swirling.  Keep on ice for 10 minutes. 
 
 6)Centrifuge 30 minutes at 8,000g or higher at 4°C.

 7)Decant  the  supernatant  and  filter it  through several layers of
   cheesecloth. Add  the RNase to a final  concentration of 0.1 mg/ml,
   and incubate at room temperature for 15-30 minutes.

 8)Using 4 Qiagen-tip 500,  pre-purify  the  supernatant as instructed
   by the Qiagen procedure. Qiagen tips are pre-equilibrated with QBT,
   then the supernatant is applied, then  washed with large volumes of
   QC, and eluted by 15 ml of QF per column.

 9)Precipitate  the DNA  by  adding  0.7  volume  of isopropanol, mix,
   and centrifuge 15,000 xg for 30 minutes at 4°C.

10)Wash the DNA pellet with ice cold 70% ethanol, and air dry.

11)Resuspend  DNA  in 18.6 ml of TE Add 20.5g  CsCl and dissolve. This
   is to be spun in two tubes in Beckman 70.1Ti rotor.

12)Add 0.4 ml of EtBr (10 mg/ml),  mix and perform ultracentrifugation
   for 2-3 days at 45,000  rpm in a Beckman 70.1Ti rotor.

13)Two  bands  should  be  visible under U.V.  Isolate the lower band,
   extract with isoamylalcohol 3-4 times, and dialyze  for a few hours
   in TE at 4°C.

14)Ethanol  precipitate  DNA,  rinse  the pellet with 70% ethanol, and
   dissolve DNA  pellet in TE, and store  at -20°C. 
   
   Solution I:   25 mM TrisHCl, pH 8.0; 50 mM Glucose 
   Solution II:  0.2 N NaOH;  1% SDS
   Solution III: 5 M  Potassium Acetate, pH 4.8. Add glacial  
                 aceticacid to a solution of 3 M potassium 
                 acetate to achieve a pH 4.8.PREPARATION OF SOURCE DNA LIGATION AND ELECTROPORATION BAC LIGATION   DNA should  be in low  melting agarose, in TAE   or stored in 0.05M
EDTA.  Dialyze the sample in 50 ml tube at 4°C against 1  X TE, 1 X PA
for 3-5hr  with one change of  solution. Melt agarose  at 65°C  for 10
minutes, transfer tube to 44-45°C water bath. Add agarase, using about
1.5 U for each 100 µl of melted gel. Digest 1 hour at 45°C.

   Set up ligation with an approximate molar ratio of vector to insert
of 10:1. Every time a new batch  of DNA is  used it is  a good idea to
set up   trial ligations  with  varying  amounts  of vector  given the
difficulties   of determining the  concentration  of  insert DNA  with
certainty.

   A typical reaction would contain 100 ng  insert DNA with an average
size  of 200 kb  and  36.5ng vector in a    volume of between 120  and
150µl.

   Reaction Mixture: 
	  
	  100 µl DNA 
	  1.8 µl pBAC (20 ng/ml)  
	 12.0 µl 10 X ligation   buffer 
	  2.0 µl 10X PA
	  0.5 µl ligase 400U/ul 
	  3.7 µl H2O

   Combine insert  DNA, vector, PA,  and H2O. Heat  5 minutes at 65°C,
cool on ice.   Add ligase buffer  and enzyme.  Mix by slowly  stirring
contents. Incubate overnight at 16°C.

   After  ligation,   carry  out  drop-dialysis  of    sample  against
approximately 25 ml 0.5 X TE, 1 X  PA for 2  hours at room temperature
in a 100 mm petri dish. 1 X PA is a mixture of spermine and spermidine
which has a combined concentration  of 1 mM (Spermidine-4HCl MW 254.6,
Spermine-3HCl   MW   348.6).    Dissolve   both    in   water,  filter
sterilize. Store frozen aliquots  at -20°C. [100  X stock = Spermidine
75 mM (0.19g/10ml) +  Spermine 30 mM  (0.104g/10 ml);  1000 X stock  =
Spermidine 750 mM (1.9g/10ml) + Spermine 300 mM (1.04g/10 ml)]PREPARATION OF COMPETENT CELLS AND BAC ELECTROPORATION1. PREPARATION OF CELLS 
 1) Inoculate  flasks of  SOB  (without  Mg++)   by diluting  a  fresh
    saturated (overnight)  culture of DH10B 1:1000  (i.e., 0.3 ml to a
    flask containing 300 ml medium).

 2) Grow with shaking at 37°C until  OD550 reaches 0.7 (no higher than
    0.8).  This should take approximately 5 hr when shaken at 200 rpm.

 3) Harvest cells by spinning in GSA rotor for 10 minutes at 5,000 rpm.

 4) Resuspend pellet in a volume of 10%  sterile glycerol equal to the
    original culture volume.

 5) Spin 10 minutes at 5,000 rpm at 4°C.

 6) Carefully  pour off supernatant (pellet  will  be quite loose) and
    resuspend  cells again  in   10% glycerol equal  to  the  original
    culture volume.

 7) Spin 10 minutes at 5,000 rpm at 4°C.

 8) Carefully  pour off supernatant, resuspend cells  in the volume of
    glycerol remaining in the centrifuge bottle. Pool the cells in one
    small centrifuge tube.

 9) Spin 10 minutes at 7,000 rpm in SS34 rotor.

10) Pour off supernatant and resuspend cells  in 10% glycerol, using a
    volume of 2.0 ml per liter of initial culture.

11) Aliquot to microfuge tubes  (100-200 µl per tube) and freeze
    quickly in a dry ice-ethanol bath. Store cells at -70°C.2. ELECTROPORATION 1) Wash  and UV sterilize cuvettes, place  on ice and prepare culture
    tubes with 0.5 ml SOC.

 2) Thaw cells and aliquot 25-30 µl to microfuge tubes on ice.

 3) Add 1-3 µl of ligation mix,  and gently mix by flicking tube
    bottom with finger.

 4) Transfer to cuvette and wipe cuvette dry.

 5) Electroporate  using  settings  of  100 Ohms,    2.5 kV,  and   25
    µFa.   This usually gives   a time constant of approximately
    2.4 msec.

 6) Immediately rinse  contents  of cuvette  with SOC and  transfer to
    culture tube using a sterile Pasteur pipet.

 7) Shake for 45 minutes at 37°C. Spread on LB plates containing 12.5
    µg/ml  chloramphenicol,   50  µg/ml  X   Gal  and   25
    µg/ml IPTG.Purification of BAC DNA via mini-preps    A major advantage of working with BAC clones is the ease with which
pure BAC DNA  can be isolated via  miniprep methods. Alkaline lysis is
superior to boiling   methods,  producing higher yields  with  greater
reproducibility, though a significant amount  of the DNA may be nicked
by   the  alkaline treatment and   coverted   from supercoiled to open
circular moleucles.   While  the low copy number   of  BACs means that
relatively much  less DNA is recovered  than from  multi-copy vectors,
sufficient DNA can be obtained from a  few ml of bacterial culture for
restriction analysis, hybridization, FISH or PCR. Because the BACs are
supercoiled,  they are resistant  to shear-induced breakage during the
isolation, hence even BACs as large as 350 kb require no extraordinary
measures  in handling   the DNA.   Although   we avoid  vortexing  the
miniprepped  DNA, it may be pipetted  using regular pipet tips without
any detectable damage to the  DNA. 

   As with large scale  preparations,  the smaller  amount of BAC  DNA
relative to  the amount of  chromosomal DNA and   protein in the cell,
means that    the BAC DNA  will  be  less  pure  than mini-prepped DNA
representing  higher copy vectors.  This  has two consequences. First,
contaminating  chromosomal DNA  may represent a   few per cent of  the
yield.  Second, the DNA is not particularly stable as large molecules,
presumably due  to  nucleases present in  the  sample. Thus  we notice
degradation of the DNA after storage for  only a few  days both at -20
and 4°C.  This  degradation  is apparant as  an inability  to generate
full length molecules  after restriciton  digestion. Phenol extraction
of   the  samples did  not   entirely  prevent  this degradation. More
consistant recovery  of BAC DNA, as  well as higher yields and greater
purity may be obtained using  the Autogen 740 automated DNA extraction
instrument (Integrated Separation Systems,  Natick, MA) describe.   In
contrast to BAC DNA prepared manually, DNA prepared by the Autogen 740
may be analyzed after more than 10 days of storage at 4°C.

   Alkaline lysis mini-preps of BAC DNA We perform the following steps
on   up to  24 samples     simultaneously. Unless  stated, pauses   or
incubations are not needed between each step. Typical yield of BAC DNA
from 3 ml cultures is 100-200 ng.

 1) Inoculate  a colony into   a 10 ml   culture containing 1.5 ml LB+
    12.5µg/ml chloramphenicol.

 2) Grow overnight at 37°C by shaking at 200 rpm. 

 3) Transfer the culture to a 1.5ml microfuge tube. 

 4) Pellet the  cells by spinning at full  speed in a microfuge for 30
    seconds, and aspriate or pour off growth medium.

 5) Thoroughly  resuspend   the  cell pellet   in  100µl chilled
    Solution I using a pipetman.

 6) Place  the  tubes on ice  and add  200µl of freshly prepared
    Solution II. Cap the tube, mix  by inversion 8-10 times and return
    tubes to ice. At this  stage the cells will  lyse and the solution
    will grow clear and viscous.

 7) Add 150µl  of Solution III.  Cap tube, mix by inversion 8-10
    times and return to ice.  The addition of  solution III will cause
    the formation of a flocculent precipitate.

 8) Centrifuge  for 6 minutes at room  temperature at  full speed in a
    microfuge.

 9) Transfer  the supernatant by pouring  to a new microfuge tube. Any
    visible debris that is transferred can be removed with a toothpick
    or pipet tip.

10) Precipitate the  DNA by adding 1  ml room temperature 100% ethanol
    and mixing by inversion.

11) Centrifuge for 6 minutes at room temperature in a microfuge. 

12) Pour  off    the supernatant   and  rinse the   pellet  by  adding
    500µl of room temperature 70% ethanol.

13) Pour off the ethanol and  drain the tube  by resting it upsidedown
    on a paper towel. Allow to dry completely.

14) Resuspend in 20µl TE. 

Solution1: 25mM TrisHCl pH 8.0 50mM Glucose 10mM EDTA After cells have
	   been resuspended, add Lysozyme to 2.5mg/ml

Solution2: 0.2N NaOH 1% SDS 

Solution3: 3M Potassium  Acetate pH 4.8 This  is a tricky  solution to
	   prepare.  It is  made by adding  glacial  acetic acid to  a
	   solution  of  5M potassium  acetate    to achieve a  pH  of
	   4.8.  This is accomplished  by  adding a minimal amount  of
	   water to the potassium  acetate and then adding  the acetic
	   acid until the  potassium acetate is  dissolved and the  pH
	   has reached 4.8. Alternatively, the solution can be made
	   by assemblying 60ml 5M KOAce, 11.5 ml glacial acetic acid, 
	   and 28.5 ml water.