基本方案
实验材料 | DNA |
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试剂、试剂盒 | TE 核苷三磷酸混合液 RNA聚合酶缓冲液 异丁醇 NaOH TCA |
仪器、耗材 | 离心机 摇床 |
实验步骤 |
1. 亚克隆编码蛋白质的目的DNA片段于质粒载体的SP6或T7启动子的下游。
2. 通过CsCl/溴化乙锭离心或PEG沉淀制备质粒DNA。
3. 用位点在终止密码子的立即下游处(理想是50~200碱基)而不存在于蛋白质编码区中的限制性内切酶切割DNA。取小份样品在琼脂糖凝胶电泳中检测。
5. 在室温建立如下的25 μl 的反应混合液(避免精胺使DNA模板沉淀) 8 μl H2O
6. 加入25 μl 缓冲液平衡酚,振荡混匀,立即抽提。转移水相于一个新微量离心管中,以异丁醇抽提两次。加入6 μl 10 mol/l 乙酸铵和70 μl 乙醇,沉淀RNA并以乙醇洗1次。
8. 按厂商的说明书往体外翻译试剂盒的配套试剂加入1~10 μl RNA。加入15 μCi[35S]标记甲硫氨酸,典型的反应在30 μl 体枳室温进行30~60 min。反应完成后,可在0~4 ℃保存1周。
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