细胞提取物中β-半乳糖苷酶的测定实验

大肠杆菌β-半乳糖苷酶 Tris-Cl 磷酸钠 ONPG Na2CO3 β-巯基乙醇 MgCl2

材料

缓冲液和溶液
贮存液稀释到适当浓度。

100XMgCl₂
0.1mol/L MgCl₂

4.5mo1/L β-巯基乙醇
临用前，加入适量的 14.7mol/Lβ-巯基乙醇贮存液。

Na₂CO₃(1mol/L)
10.6 g 无水固体溶于 100 ml 水中。

1xONPG
ONPG 溶于 0.1mol/L 磷酸钠（pH7.5) 中，浓度为 4 mg/ml。

磷酸钠（0.1mol/L，pH7.5）
混合 41 ml 0.2mol/L Na₂HPO₄•2H₂O(M_t=178.05;35.61 g/L)，9 ml 0.2mol/L NaH₂PO₄•2H₂O(M_r=156.01;31.21 g/L) 和 50 ml 水。

Tris-Cl(1mol/L,pH7.8)



酶和缓冲液

大肠杆菌β-半乳糖苷酶
该酶是商品化的（如 Sigma 公司)

附加试剂
本方案步骤 1 需要列在本章方案 5 中的试剂。

细胞和组织

转染了感兴趣 DNA 的哺乳动物培养细胞
使用第 16 章的某种转染方案，用带有半乳糖苷酶报道基因的质粒（如 CLONTECH 公司的报道分子系列载体；请见图 17-5) 转染细胞。



方法

1. 如方案 5 步骤 1~4 所述，用转染的细胞制备细胞抽提物。取约 30ul 抽提物测定β-半乳糖苷酶。所需抽提物的确切数量要根据驱动β-半乳糖苷酶基因表达的启动子的强度、转染效率和测定时的孵育时间来确定。如果要用热处理灭活内源性β-半乳糖苷酶，测定前把细胞裂解物在 50°C 孵育 45~60 min。预热处理也会使荧光素酶失活，所以如果使用预热处理，荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性测定要分开用不同一份细胞裂解物进行。

2. 对于每个用于测定的转染细胞裂解物样品，混合：

100xMg²⁺溶液                        3ul
1xONPG                                 66ul
细胞抽提物                             30ul
0.1mol/L 磷酸钠（PH7.5)       201ul

阴性和阳性对照都是必需的，它们分别检査内源性抑制剂和β-半乳糖苷酶是否存在。所有对照实验应该含有 30ul 假转染细胞的裂解物。此外，阳性对照应该包括 1ul 商品化的大肠杆菌β-半乳糖苷酶制品<50 单位/ml。商品化的酶制品应该溶在 0.1mol/L 磷酸钠（PH7.5) 中，浓度为 3000 单位/ml。临用前，把 1ul β—半乳糖苷酶贮存液加到 60ul 0.1mol/L 磷酸钠（PH7.5) 中配成 50 单位/ml 的酶工作液。每单位大肠杆菌半乳糖苷酶定义为在 37°C，1 min 内水解 1umol ONPG 底物的酶量。

3. 反应液在 37°C 孵育 30 min 或者直到淡黄色出现。大多数细胞类型中，内源性β-半乳糖苷酶的背景非常低，允许孵育时间长到 4~6 h。

4. 每个管子加入 500ul 1mol/L Na₂CO₃ 使反应终止。在分光光度计上读 420nm 波长的光密度值。
测量的线性范围是 0.2~0.8OD₄₂₀。如果测量值在线性范围外, 用少一些蛋白抽提物进行重复实验。抽提物可以用 0.25mol/L Tris-Cl(pH7.8) 稀释以减低蛋白浓度。