实验方法原理 | 在体外,内皮细胞在内皮细胞生长因子存在的条件下可迅速增殖,并可传代,可作为内皮细胞增殖,细胞因子分泌、表型等研究的模型。 |
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实验材料 | 胶原酶 血清 |
试剂、试剂盒 | Cord Buffor 硫酸链霉素 生埋盐水 EDTA-Na 明胶 |
仪器、耗材 | 插管 止血钳 注射器 手套 丝线 饭盒 匀浆机 离心机 振荡器 培养瓶 CO孵箱 显微镜 超净工作台 孔板 |
实验步骤 |
一、脐带内皮细胞的分离
(2)在脐带一端找到静脉,插入脐带静脉插管,用2 根粗丝线扎牢,用Cord Buffer抽吸有的30 ml注射器冲洗静脉腔,至将脐血洗净。
(3)赶出静脉腔内残余液体,将脐带另一端用止血钳夹闭,用10 ml注射器连接针头,注入37 ℃预热的0.1 %胶原酶约6-8 ml,放入37 ℃ Cord Buffer中保温6-10 min。
(4)吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液,加入预加有20 ml Cord Buffer的离心管中,冲洗静脉腔,一并加入离心管中。
(5)离心,1500 rpm,10 min弃上清,用5~7 ml 20 %FCS,RPMT 1640重悬细胞,转入培养瓶,放5 %CO孵箱。
2. 在4 ℃条件下用震荡器机械震荡约1.5 h。
3. 离心,10000 g,40 min,收取上清液。
4. 按0.5 %加硫酸链霉素,4 ℃过夜。
5. 离心,20000 g,40 min,收取上清液。
6. 用紫外分光光度测280 nm,260 nm OD值按公式计算蛋白含量。
1. 培养瓶包被明胶
2. 细胞悬液加入包被明胶的96孔板,每孔100 μl,5×103个细胞。
3. 放置于5 %CO孵箱,24 h,待细胞全部贴壁生长。
4. 每孔加待检样品100 μl,每个稀释度设3个复孔,并设培养基阴性对照。
5. 放5 %CO孵育,48~72 h,待阴性对照与阳性有明显差别时,加3HTdR,每孔0.5 μci/50 μl。
7. 细胞收集仪收集细胞,检测Cpm值可计算刺激指数。
展开 |
注意事项 |
1. 严格无菌操作,防止在分离、培养和传代内皮细胞过程中发生污染。
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