一、目的
1、熟练掌握食品中N-亚硝胺化合物的测定原理。
2、掌握食品中N-亚硝胺化合物的测定方法。
二、测定原理
本法是测定食品中挥发性N-亚硝胺总量的方法。
食品中挥发性亚硝胺经水蒸气蒸馏纯化后，经过紫外光照射，分解释放为亚硝酸根。然后利用强碱性离子交换树脂浓缩，在酸性条件下与对位氨基苯磺酸形成重氮盐，最后与N-萘乙烯二胺二盐酸盐形成红色偶氮染料。颜色的深浅与N-亚硝胺的含量成正比。
三、试剂
1.0.1mol/L磷酸缓冲溶液(PH7)：分别吸取0.1mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)61.9ml和0.1mol/L磷酸氢二钠(NaH2PO4)39.0ml，将两者混合而成缓冲溶液。
2.300g/L醋酸溶液
3.0.5mol/L氢氧化钠溶液
4.1.7mol/L盐酸溶液
5.100μg/ml二乙基亚硝胺标准溶液
6.100μg/ml亚硝酸钠标准溶液
7.1mol/L氢氧化钠溶液：用正丁醇饱和
8.10g/L硫酸锌溶液
9.强碱性离子交换树脂：交链度8，粒度150目。
10.显色剂：
显色剂A――10g/L对位氨基苯磺酸的300g/L醋酸溶液
显色剂B――2g/LN-1-萘乙烯二胺二盐酸盐的300g/L醋酸溶液
显色剂C――10g/L对位氨基苯磺酸的1.7mol/L盐酸溶液
显色剂D――10g/LN-1-萘乙烯二胺二盐酸盐溶液
四、仪器和用具
分光光度计、紫外灯：BR-69盘形杀菌灯(10W)。
五、操作方法
1.亚硝胺标准曲线绘制
准确吸取亚硝胺标准溶液0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10ml，分别放入小培养皿中，在小培养皿中分别加入PH7的磷酸缓冲溶液，使溶液的总体积为2.0ml，摇匀。在紫外光下照1min。然后依次加入0.5ml显色剂A，摇匀，再加入0.5ml显色剂B，使溶液呈玫瑰红色后，分别在550nm波长下用分光光度计测定其吸光度，然后绘制其标准曲线。
2.样品的制备
液体样品：称取10.0-20.0g样品(根据样品中亚硝胺的含量大小称量)，移入100ml容量瓶中，加入0.5mol/L氢氧化钠溶液，调整其浓度为1mol/L，摇匀后过滤，收集滤液备用。
固体样品：将固体样品捣碎或研磨搅拌均匀，称取20.0g，用正丁醇饱和过的1mol/L氢氧化钠溶液将其转移入100ml容量瓶中至刻度，摇匀后浸泡过夜，最后离心取清液备用。
3.挥发性N-亚硝胺总量的测定
吸取样品50ml清液置于蒸馏瓶内，将其进行夹层保温水蒸气蒸馏，收集馏出液25ml，用300g/L醋酸溶液调节其PH值至3-4。再继续蒸馏，再收集馏出液25ml，用0.5mol/L氢氧化钠调至PH7-8。在紫外光下照射15min，通过强碱性离子(氯离子型)交换柱(φ1cm×0.5cm)浓缩，用少量蒸馏水水洗，然后用1mol/L氯化钠溶液洗脱亚硝酸根，然后分管收集洗脱液，每管1ml，直至所收集的洗脱液加入显色剂不显色为止。在管中各加入1.0mlPH7的磷酸缓冲溶液、0.5ml显色剂A，摇匀，然后再加入0.5ml显色剂B，待溶液呈玫瑰红色后，在分光光度计以550nm波长下测定其吸光度，根据其吸光度，从标准曲线中查得每管亚硝胺的含量，计算其总含量。
六、计算
X＝×1000 
(3-2)
式中：X――挥发性N-亚硝胺含量，μg/kg；
m1――相当于挥发性N-亚硝胺标准的量，μg；
m――测定时样品溶液相当于样品的量，g。
注意事项
对于亚硝酸盐含量高的样品，由于二甲胺与亚硝酸盐在酸性条件下能结合产生亚硝胺，因此，会影响N-亚硝胺的测定结果。可以用同样的比色法计算出亚硝酸盐相当于挥发性N-亚硝胺含量X0，然后再减去X0得到实际样品中挥发性N-亚硝胺含量。
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