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β2型受体激动剂(又称瘦肉精)是一类人工合成药物,主要用于人、兽支气管哮喘的防治,同时对动物能起到降低脂肪含量提高瘦肉率的作用[1]。 人摄入瘦肉精后可能引起血压升高、心率加快、头晕、心悸等心血管系统中毒反应,严重的甚至导致死亡[2,3]。 鉴于其对人体健康危害的严重性,2002年我国就已将 β2受体激动剂列入《食用动物禁用兽药及其化合物清单》,规定动物源性食品中不得检出[4]。 董峰光等[5]对烟台市2012-2017年间市售畜禽肉中 β受体激动剂污染状况及危险性进行了评估,发现依然有违法添加情况,且农贸市场样品中 β受体激动剂的检出率高于商店和网店。
目前,动物源性食品中瘦肉精的测定方法有酶联免疫吸附法[6]、气相色谱-质谱法[7,8]、液相色谱法[9]、毛细管电泳[10]以及液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[11,12,13]等。 与其它方法相比较, HPLC-MS/MS具有灵敏度高、重现性好、抗干扰能力强和定性能力强等特点,是痕量兽药残留分析的首选方法,在瘦肉精残留检测中应用广泛。 酶水解提取结合固相萃取净化常用于动物性食品中 β2受体激动剂分析的样品前处理[14],也是国标(GB/T 21313-2007)中瘦肉精残留测定中采用的方法,缺点是处理时间长、步骤繁琐、材料成本高以及需特殊仪器设备。 QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged和Safe)样品前处理方法以快速、简单、价格低廉、有效和耐用著称,目前已用于多种 β型受体激动剂残留的分析[15,16]。 但以往的QuEChERS方法往往需要称量每一种吸附材料的质量,再进行条件优化,导致大批量样品的分析效率低,方法开发难度大,本研究采用商品化QuEChERS试剂盒可以大大简化操作过程。 本文拟对酸水解和酶水解两种提取方式进行对比研究,结合QuEChERS净化和液相色谱串联质谱,建立动物性食品中特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺和克仑特罗4种 β2型受体激动剂的快速定性定量确证检测方法。
1 实验部分
1.1 试剂和仪器
沙丁胺醇(18559-94-9)、特布他林半硫酸盐(23031-32-5)、莱克多巴胺盐酸盐(90274-24-1)、克伦特罗盐酸盐(37148-27-9)(纯度≥97%)以及沙丁胺醇-D3内标(100 mg/L)购自德国DR公司;特布他林-D9内标和莱克多巴胺-D6内标(纯度≥98%)购自加拿大TRC公司;克伦特罗-D9内标(纯度≥98%)购自德国WITEGA公司。乙酸乙酯、甲醇、甲酸和乙酸铵购自德国CNW公司,试剂纯度为色谱纯; β-葡萄糖酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶(≥8500 units/mg)购自美国Sigma公司;NaOH和三氯乙酸购自国药集团化学试剂有限公司(分析纯)。 明澈TM-D 24UV纯水系统(Merck Millipore)制备一级纯水。
HPLC串联三重四级杆MS:配备Aglilent1260型HPLC(美国安捷伦公司)和API4000型MS(配备电喷雾离子源,美国AB公司);EVA32型多功能样品氮吹浓缩仪(北京普立泰科);PQS-3型瘦肉精专用高效QuEChERS样品前处理试剂盒(北京普立泰科);Coulter X-12R型低温高速离心机(美国贝克曼库尔特公司);AG-285型精密电子天平(法国梅特尔公司);TW20型恒温水浴箱(德国优莱博公司);AS3120B型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);GD-16型高速研磨均质仪(深圳新锐科技公司)。
1.2 标准溶液配制
分别准确称取适量标准品,用甲醇溶解,配制成质量浓度为100 mg/L的储备液;准确吸取上述标准储备液各1 mL,用初始流动相比例的溶剂定容至100 mL,配制成质量浓度为1 mg/L的混合标准溶液;逐级稀释混合标准溶液,配成以下质量浓度:0、10、20、50、100 和200 μg/L。 内标标准溶液配制方法同上,用初始流动相比例的溶剂配成浓度为100 μg/L的混合内标使用液。
1.3 样品前处理
1.3.1 酸水解提取法
猪肉或牛肉样品切成小块后经均质仪充分搅碎混匀,称取2 g(精确至0.01 g)置于QuEChERS萃取管中,加入内标混合溶液(内标最终浓度2.5 μg/L),以1：1(体积比)的甲醇-水溶液(含质量分数1%的三氯乙酸)20 mL分两次提取,振荡混匀后,在9000 r/min、4℃下离心5 min,合并上清液。 取上清液10 mL至QuEChERS净化管中,振荡混匀后在9000 r/min、4 ℃下离心5 min。取上清液于50 ℃水浴、微弱N2气流下吹至剩余液体约3 mL,以10 moL/L氢氧化钠溶液调节pH=11.0,采用10 mL乙酸乙酯分两次提取,振荡混合后于9000 r/min、4 ℃下离心5 min,合并乙酸乙酯层,氮吹至近干。 加入1.0 mL初始流动相溶剂,过0.22 μm滤膜后供HPLC-MS/MS分析。
1.3.2 酶水解提取法
猪肉或牛肉样品切成小块后经均质仪充分搅碎混匀,称取2 g(精确至0.01 g)置于QuEChERS萃取管中,加入内标混合溶液(内标最终浓度2.5 μg/L)和2.0 moL/L乙酸铵溶液(pH=5.2)10 mL,振荡混匀,加入 β-葡萄糖酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶100 μL,置于37 ℃水浴箱中水解16 h(期间多次取出振荡混匀)。 取出样品,冷却至室温,加入甲醇10 mL,振荡混匀,9000 r/min、4 ℃下离心5 min,重复提取1次,合并上清液。 吸取10 mL上清液至QuEChERS净化管中,9000 r/min、4 ℃下离心5 min,收集上清液于50 ℃水浴、微弱氮气流下吹至剩余液体约3 mL,后续操作同酸水解提取法。
1.3.3 混合基质标准溶液制备
称取阴性样品,按酶水解法样品提取及净化步骤,得到空白基质溶液。吸取混合标准使用液系列各0.1 mL,用空白基质溶液定容至1.0 mL,得到混合基质标准溶液系列浓度为0、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μg/L,内标浓度均为2.5 μg/L。
1.4 色谱、质谱条件
色谱条件 色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm),柱温40 ℃,进样体积10 μL,流速300 μL/min;流动相A相为甲醇,B相为水,A相和B相均含0.1%甲酸;梯度洗脱程序:0~2.0 min,5%A;2.0~6.0 min,5%90%A;6.0~13.0 min,90%A;13.1~20.0 min,5%A。
质谱条件 电喷雾离子源正离子扫描(ESI+),多反应监测模式(multiple reaction monitoring,MRM);离子化电压4500 V,雾化气压力0.38 MPa,气帘气压力0.17 MPa,辅助气流速0.38 MPa,离子源温度550 ℃,碰撞池出口电压8 V,驻留时间100 ms。
2 结果与讨论
2.1 色谱质谱条件优化
采用微量进样泵将100 μg/L的特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺和克伦特罗标准溶液以10 μL/min速度连续注入质谱系统,通过一级质谱质谱扫描确认目标化合物的准分子离子,优化去簇电压(Declustering Potential,DP)和入口电压(Entrance Potential,EP)。 以准分子离子为母离子进行二级质谱扫描,优化碰撞能量(Collision Energy,CE)和碰撞室出口电压,选择丰度较高又稳定的碎片离子分别为定性、定量子离子。 按照欧盟2002/657/EC对于兽药残留等禁用药物检测的规定,液相色谱串联质谱中选定1个母离子和2个子离子即可满足定性确证所需4个鉴定点的要求,从而达到定性确证的目的。 优化后部分质谱参数见表1。
 | 表1 4种瘦肉精质谱参数Table 1 MS parameters for 4 compounds |
色谱分离采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱,该色谱柱适用pH值范围广(pH 1~12),同时对目标化合物具有良好的保留。 流动相为含0.1%甲酸的甲醇(A相)和水(B相),流动相中加入甲酸能够提高4种化合物在ESI+模式下的离子化效率。 此外,当样品中甲醇比例低于5%时,被分析物峰形良好、分离度好、灵敏度高,可达到基线分离。 如图1所示,出峰顺序依次为特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺和克仑特罗。
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 | 图1 基质匹配混合标准溶液总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram(TIC) of the matrix-matched mixed standard solution(5.0 μg/L) of 4 compounds(internal standard:2.5 μg/L) a.terbutaline; b.salbutamol; c.ractompamine; d.clenbuterol |
2.2 样品提取和净化
目前常用 β-葡萄糖酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶酶水解的方式将结合态转化为游离态,后续结合固相萃取净化,整个样品处理过程耗时较长,在急性瘦肉精中毒事件发生以后应急响应较慢。 本文采用甲醇水溶液(含1%三氯乙酸)提取,三氯乙酸具有释放结合态瘦肉精和沉淀蛋白的作用,同时提供酸性溶液环境,利于弱碱性瘦肉精离子化后的提取。 提取液经QuEChERS净化、乙酸乙酯反提以及氮吹、复溶,整个前处理过程可保持在1 h之内,非常适合急性瘦肉精中毒事件应急检测的快速响应。 同时将酸水解提取与酶水解提取进行对比,加入 β-葡萄糖酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶在2.0 mol/L乙酸铵缓冲溶液(pH=5.2)中37 ℃恒温水浴反应过夜,后续处理同酸水解法。 QuEChERS净化管中的C18、石墨化炭黑(GCB)、 N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂能够有效吸附脂质、色素和有机酸、重金属等干扰成分,对色谱柱起到保护作用的同时也可减少质谱干扰。 此外,特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺和克仑特罗均为弱碱性化合物,净化液经浓NaOH溶液调节pH=11.0时呈分子状态,更容易进入乙酸乙酯层。
2.3 线性范围、检出限和定量限
按酶水解法处理得到空白阴性样品,添加同位素内标混标和不同浓度的标准溶液混标制备基质匹配标准溶液进样分析。 以目标化合物浓度作为横坐标,被分析物定量离子峰峰面积与相应内标的定量离子峰峰面积比值作为纵坐标,获得各被分析物的标准曲线和线性范围,线性范围均为1.020.0 μg/L,线性相关系数均大于0.999。 按3倍信噪比( S/N=3)和10倍信噪比( S/N=10)对应的浓度作为检出限和定量限,分别为0.1 μg/kg和0.3 μg/kg,结果与国家标准检验方法相当。
2.4 准确度和精密度
向猪肉和牛肉样品中添加2.0和10.0 μg/kg两个水平的4种 β2受体激动剂混合标准溶液及同位素内标混标,按酶水解法提取样品,每个浓度水平平行制备6份样品并测定。 被分析物在猪肉和牛肉中的回收率范围分别为85.6%~112%和78.5%~110%,相对标准偏差(RSD)分别为2.8%~7.5%和4.5%~8.9%(表2)。 符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中样品含量≤0.100 mg/kg时,回收率介于60%~120%、精密度介于0%~20%之间的规定,表明酶水解法结果准确、可靠。
| 表2 加标回收率及精密度试验结果( n=6)Table 2 Results of recoveries and precisions( n=6) |
2.5 实际样品分析
从市场购买猪肉和牛肉样品,按照前述样品制备方法制备样品,检测到猪肉莱克多巴胺阳性样品1份,牛肉克伦特罗阳性样品3份。 分别采用酸水解提取法和酶水解提取法测得猪肉样品中莱克多巴胺含量为8.16和10.4 μg/kg,测得牛肉样品中克伦特罗含量分别为1.09、2.70、3.74 μg/kg和1.31、2.65、3.75 μg/kg。 根据文献[17],克伦特罗为苯胺型结构,蛋白结合率低,动物组织中主要以游离形式存在,而莱克多巴胺为苯酚型结构,苯环上的极性基团极易与体内的葡萄糖醛苷酸等发生轭合反应,大部分呈结合态形式存在。 对酸水解和酶水解两种提取方式结合QuEChERS净化及HPLC-MS/MS测定的结果显示,酸水解提取法和酶水解提取法处理样品均能检测到莱克多巴胺和克伦特罗。 克伦特罗采用酸水解提取法和酶水解提取法所得结果相近,而莱克多巴胺酸水解提取法所得结果比酶水解法低约20%,表明酸水解法也具有释放结合态瘦肉精的作用,但与酶水解法相比释放程度稍低。 使用酸水解和酶水解提取所得空白及阳性样品提取离子流色谱图如图2所示,猪肉和牛肉阴性样品在莱克多巴胺和克伦特罗标准品出峰位置无干扰峰出现,阳性样品中莱克多巴胺、克伦特罗与相近浓度的基质匹配标准溶液的保留时间、定性定量离子对及丰度比结果一致。
 | 图2 酸水解和酶水解MRM对比谱图Fig.2 MRM chromatograms of samples by acid hydrolysis extraction and enzymatic hydrolysis extraction A.acid hydrolysis extraction method; B.enzymatic hydrolysis extraction method |
3 结 论
采用酸水解提取和酶水解提取结合QuEChERS净化-HPLC/MS/MS建立了特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺和克仑特罗的快速定性确证和定量检测方法。 其中酸水解提取所需时间较短,可实现对中毒检材的快速定性确证,有助于临床医生的鉴别诊断及对中毒病人的及时临床救治,后续利用酶水解提取方法进行准确定量检测。 本方法除了用于急性瘦肉精中毒应急检测,还可望用于食品安全风险监测日常检测工作中。
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