肌球蛋白的纯化
DEAE纯化肌肉肌球蛋白
| 实验材料 | 冷冻肌肉 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 肌球蛋白抽提溶液 |
| 仪器、耗材 | 玻璃器皿 |
| 实验步骤 | 1. 准备下面的贮存液（都冷却到 4℃）。 肌球蛋白抽提溶液：0.5 mol/L KCl，0.1 mol/L K2HPO4 几升冷的用玻璃器皿蒸馏过的水（dH2O） 4 mol/L KCl 0.5 mol/L KCI 0.5 mol/L CH3COOH 0.5 moI/L K+EDTA，pH 7.0 1 mol/L NaHCO3 用 10 mmol/L K+EDTA 饱和（NH4）2SO4 1 L dH2O 中加 780 g Schwartz-Mann 的超纯（NH4）2SO4，然后边加热边搅拌直到溶解。 估计一下体积，加入 0.5 mol/L K+EDTA 使终浓度为 10 mmol/L。用 NH4Cl 调 pH 使表观值为 8.2。少量样品用 dH2O 以 1:10 稀释，pH 值应该为 7.0 左右。 破坏肌肉细胞 2. 可接受的方法处死鸡或兔或者使用 Pel-Freez 的冷冻肌肉（冷冻材料在通过绞肉机前先融化一部分）。 3. 快速剥掉鸡或兔的皮，然后从你希望回收肌动蛋白和肌球蛋白的部位解剖下来 300 克合适的肌肉，然后把它们放在冰上。 4. 冷的肌肉用一个事先经过冰冷的 10 mmol/L K+EDTA，pH 7.0 浸泡至 4℃ 的绞肉机绞两次并称重。 抽提肌动蛋白和肌球蛋白 5. 3 倍体积的肌球蛋白抽提溶液（w/v）在冰库搅拌抽提，正好 10 分钟。 6. 混和物分到 6 个 150 ml 离心瓶中，用 GSA 转头以最髙速（13000 r/min，17310 g）离心 15 分钟使不溶的肌肉残渣沉淀下来。 分离肌球蛋白 7. 转移上清，测量上清的体积，用 0.5 mol/L 乙酸调 pH 到 6.6。 8. 在轻轻搅拌的同时，慢慢地用 10 倍体积冷的 dH2O 稀释来沉淀肌球蛋白以及一些抽提到的肌动蛋白。再次检査 pH 值，如果需要就调节 pH 到 6.6。 9. 用大容量离心机，例如带 0.5 L 瓶的 GS3 型，以最高速（9000 r/min，8622 g）离心 20 分钟离下沉淀物。弃掉清亮的上清，留下白色致密的沉淀物。 肌球蛋白的酸沉淀 10. 在 50 mI 2 mol/L KCl 中溶解沉淀物。用一个带松的研杵的 Dounce 牌匀浆器（一种用玻璃研杵的玻璃匀浆器）以保证彻底破坏沉淀块。 11. 测量溶液总体积并假设沉淀物的 KCI 浓度为 45 mmol/L 来计算 KCl 的浓度。用 4 mol/L KCl 调节 KCl 浓度到 0.5 mol/L，然后加足量的 0.5 mol/L KCl 来降低黏滞度使足以进行下面的操作。溶液转移到带刻度的 1 L 塑料烧杯中。 12. 检査溶液的 pH 值，如果必要就用 NaHCO3 调 pH 值至 6.7~6.8。 13. 不停地搅拌，缓慢加入冷的蒸馏水来降低 KCl 的浓度直至 0.4 mol/L。 14. 离心（高速 SS-34 型，20000 r/min，32180 g；或者 GSA 型，13000 r/min，17130 g）10 分钟，把所有沉淀物都离心下来。保留上清。 15. 加冷的 dH2O 以进一步降低 KCl 的浓度至 0.3 mol/L。如前进行沉淀；保留上清和沉淀物。 16. 测量上清的体积并在不停搅拌的情况下用冷的蒸馏水小心地稀释直至 KCl 浓度为 0.04 mol/L。 17. 离心沉淀肌球蛋白粗丝（高速 SS-34 型或 GSA 型离心 10 分钟）并弃掉上清。 18. 估计沉淀物的体积，然后加足够的 4 mol/L KCl 来提高 KCl 的浓度到 0.5 mol/L，然后用 0.5 mol/L KCl 稀释样品到 450 ml。 用（NH4）2SO4 沉淀肌球蛋白 19. 缓慢加入饱和的（NH4）2SO4 （向下）使（NH4）2SO4 饱和度为 40%，不停搅拌使充分混合。 20. 离心沉淀（高速 GSA 型 17310 g 离心 15 分钟），保留沉淀作为 “40% （NH4）2SO4 时的样品”。 21. 不停搅拌的情况下在上清中加入足够体积的饱和（NH4）2SO4 使其饱和度为 50%，加入的（NH4）2SO4 体积会是肌球蛋白溶液体积的 1/5。搅拌 15 分钟。 22. 离心沉淀（见步骤 20 ) 并弃掉上清。标记上“50% （NH4）2SO4 时的样品”。 23. 为了使蛋白浓度保持最大，在最小体积的 0.5 mol/L KCl 中重悬 40% 和 50% 的 （NH4）2SO4 沉淀物（用刮刀直接把固态的（NH4）2SO4 沉淀放进透析袋）。 24. 在 1 L 0.5 mol/L KCl，10 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0，10 mmol/L K+EDTA，pH 7.0 中对（NH4）2SO4 沉淀的样品进行透析，在 24 小时内至少换 2 次透析液。 25. 20000 r/min（31180 g）离心 30 分钟使溶液变清。这些肌球蛋白在 KCl-EDTA 中可以稳定数周。为了保存更长时间，它可以和甘油以 1:1 混合并贮存在 -20℃。此外，可以让肌球蛋白留在（NH4）2SO4 中，盖要的时候透析一小部分。 26. 测定肌球蛋白制品的蛋白浓度，ATP 酶活性，通过 SDS-PAGE 测定纯度，和/或通过体外移动试验测定其功能。 |
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